Вiрусний гипатит С
Вступ
Вiруснi гепатити займають одне з перших мiсць в iнфекцiйнiй патологiї людини, пiсля грипу i респiраторних вiрусних захворювань.
По своїй величинi соцiально-економiчного збитку та медичнiй значимостi вiруснi гепатити займають ведуче мiсце в iнфекцiйнiй патологiї України та iнших країн. Щорiчно число захворiлих гострими вiрусними гепатитами досягає бiльш мiльйона чоловiк.
Вiруснi гепатити В, С и D - найбiльш важкi форми гепатитiв, що ведуть до хронiзацiї з наступним формуванням цирозу печiнки, первинного раку печiнки i часто приводять до летальних результатiв. Так за даними ВООЗ (1995 рiк) хронiзацiя при вiрусному гепатитi В складає 10%, при вiрусному гепатитi С 70%, при вiрусному гепатитi D - 10-15%. Летальнiсть при вiрусному гепатитi А складає 0,6%, при вiрусному гепатитi В - 1,4%, С - 1-2%, D - 30%.
доти, поки медичнi аналiзи не виявляли їх десятки рокiв, протягом яких їхня печiнка повiльно руйнувалася. Інодi люди могли дiзнаватися про те, що хворi гепатитом С, при спробi стати донором кровi, тому, що в банках кровi заведено перевiряти її на вiруси.
пiдставою для пересадження печiнки. Хоча проти гепатитiв А и В використовуються вакцини, не iснує вакцини проти гепатиту С. Вакцина проти вiрусу гепатиту С дотепер не розроблена. Основними проблемами на шляху розробки вакцини є наявнiсть гiперварiабельних дiлянок у геномi ВГС, висока частота мутацiй вiрусу i слабка гуморальна вiдповiдь на вакцину.
Якщо ранiше, до 1993 - 1994 р. р., причиною поширення парентеральних форм передачi вiрусної iнфекцiї були медичнi манiпуляцiї, то останнiм часом усе бiльшу питому вагу в причинi їхнього поширення займає наркоманiя (парентеральне застосування наркотикiв), унаслiдок чого в найближчi роки варто очiкувати значний пiдйом захворюваностi вiрусними гепатитами серед населення України.
полiмеразна реакцiя мiцно ввiйшли в практичну вiрусологiю. Широке впровадження маркерної дiагностики дозволило вирiшувати питання як клiнiчної дiагностики, так i багато епiдемiологiчних аспектiв цих iнфекцiй.
Звичайне лiкування для ВГС не є унiверсально ефективним, так що пошук нових лiкарських засобiв на сьогоднiшнiй день є актуальним питанням.
Тому, метою даної роботи було вивчення ефективностi застосування iмуномодуляторiв при лiкуваннi гепатиту С.
До задач дослiдження входило:
Вивчення iмунних показникiв при ВГС
Визначення iмунних показникiв при лiкуваннi хворих на ВГС циклофероном.
Вивчення ефективностi застосування амiксина при лiкуваннi ВГС.
1. Огляд лiтератури
1. 1 Класифiкацiя вiрусу гепатиту С
ВГС єдиний член роду Hepacivirus у сiмействi Flaviviridae, у яке входять такi вiруси, як вiрус дiареї бикiв i лихоманки свиней (рiд Pestivirus) i вiрус жовтої лихоманки, вiрус денге i GB-вiруси: GBV-A, GBV-B i GBV-C/HGV (рiд Flavivirus).
Пiд словами "вiрус гепатиту С" мається на увазi гетерогенна група вiрусiв, що мiстять РНК. Їхня класифiкацiя заснована на генетичнiй подiбностi. Найбiльш визнана номенклатура [Simor, 1992] розрiзняє шiстьох основних генетичних груп i ряд видiлених пiдтипiв, що мають найбiльшу подiбнiсть. Типи нумеруються, починаючи з одиницi, а пiдтипам привласнюють букви a, b i с у вiдповiдностi з годом вiдкриття.
У 1990 роцi в Х'юстонi було показано, що гепатит С - один iз шести найбiльше часто iдентифiкуючих гепатовiрусiв - iншими є A, B, D, E, G. Усi випадки запалення печiнки приводять до порушення функцiй печiнки. Гепатит С звичайно розглядається як найбiльш небезпечний серед цих вiрусiв [Кузин, 1999].
1. 2 Будова вiрусу гепатиту С
Нуклеокапсид мiстить РНК вiрусу гепатиту С. Зверху нуклеокапсид покритий лiпiдною оболонкою з утопленими в нiй оболонковими бiлками, кодованими РНК ВГС. Геном вiрусу представлений одноланцюговою лiнiйною молекулою РНК позитивної полярностi, довжиною близько 9600 нуклеотидiв. Органiзацiя геному ВГС подiбна iншим флавiвiрусам. в ньому видiляють двi зони, якi кодують структурнi i неструктурнi (функцiональнi) бiлки.
Гени, що кодують структурнi бiлки, розташованi в 5' областi геному вiрусу, а неструктурнi в 3' областi. Геном ВГС має одну вiдкриту рамку зчитування (ВРЗ), єдиний полiпептид (приблизно в 3000 амiнокислот), що пiд дiєю вiрусних i клiтинних протеаз нарiзується на структурнi i неструктурнi бiлки. [Зеваков, 1998]
До структурних бiлок вiдносять бiлки, кодованi Core, El i Е2 (р21) з молекулярною масою - 21 k, усiчена (р19) i форма (р16), виявлена в ядерцях iнфiкованих гепатоцитiв. На своїй поверхнi С-бiлок несе рiзнi висококонсервативнi В-клiтиннi епiтопи, iснування яких надзвичайно важливо для виявлення антитiл до ВГС у процесi лабораторної дiагностики гепатиту С [Laverdant, 1989].
Зони РНК ВГС - Е1 i Е2 кодують бiлки з молекулярною масою 31 i 70 k. Цi бiлки мають кiлька дiлянок N-глiкозилювання; в Е1 бiлку визначено до 6 таких дiлянок, а в Е2 - 11. У дiлянцi Е2 укладена iнформацiя про невеликий бiлок - р7, що у структурi вiрусу не виявлений.
Позначення регiонiв, розташованих ближче до 3'- кiнцю РНК ВГС - як зон, що несуть iнформацiю про неструктурнi бiлки вiрусу, указує на те, що цi бiлки не є структурними компонентами вiрусної частки. У неструктурнiй зонi РНК ВГС видiляють дiлянки, позначенi як: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B. Бiльшiсть з бiлкiв, кодованих неструктурними зонами РНК ВГС, необхiднi для реплiкацiї вiрусу.
Порiвняльний аналiз нуклеотидних послiдовностей РНК iзолятiв ВГС, отриманих у рiзних регiонах свiту i навiть у процесi захворювання вiд того самого пацiєнта, виявив основну особливiсть цього вiрусу - високу гетерогеннiсть РНК. Положення про значної генетичний варiабельностi РНК ВГС стало в основу теорiї, що пояснюють: тривале (iнодi довiчне) носiйство вiрусу, частий розвиток хронiчного захворювання, труднощi в терапiї i створеннi ефективних вакцинних препаратiв. Найбiльш значнi вiдмiнностi послiдовностей РНК ВГС зосередженi в N-кiнцевiй частинi регiону Е2, що позначають - "гiперварiабельний регiон" (HVR).
В даний час визначено 6 основних генотипiв i понад 100 субтипiв ВГС. Генотипи 1а, 1у, 2а, 2у, 2з i За складають бiльш 90% ВГС - iзолятiв, отриманих у Пiвнiчнiй i Пiвденнiй Америцi, Європi, Росiї, Китаї, Японiї й Австралiї/Нової Зеландiї. Генотипи 4, 5а i 6 вiдповiдно реєструються в Центральнiй i Пiвденнiй Африцi, Пiвденно-Схiднiй Азiї. У Росiї i країнах СНД зареєстрована перевага генотипу 16 (не менш 68,9%). Вважається, що пацiєнти, iнфiкованi генотипом 1 (особливо 1в), вiдповiдають гiрше на лiкування в порiвняннi з пацiєнтами, iнфiкованими iншими генотипами вiрусу [Yuasa, 1991].
пацiєнта при зараженнi. Цi мутантнi форми можуть сприяти бiльш активної чи реплiкацiї можуть допомагати вiрусу ухилятися вiд iмунної вiдповiдi органiзму i потенцiйно впливати на результат гострої iнфекцiї, розходження в плинi захворювання i вiдповiдi на iнтерферонотерапiю [Жданов, 1986].
Життєвий цикл ВГС включає утворення реплiкативних (негативних - ) ланцюгiв РНК, що служать матрицею для утворення геномних молекул. Частота виявлення реплiкативной форми РНК ВГС за даними одних дослiдникiв складає 35% випадкiв [Абдулмеджидова, 2000], тодi як за даними iншi до 100% [Chang, 2000]. Істотна розбiжнiсть даних може порозумiватися труднощями, що виникають при визначеннi негативної-РНК, тому що кiлькiсть негативних ланцюгiв РНК на один [lanford, 1995] - три [Mellor, 1998] порядку нижче, нiж позитивна + РНК. Це порозумiвається тим, що одна молекула -РНК може служити матрицею для синтезу декiлькох геномних молекул [Маслова, 2000].
Серед дослiдникiв немає єдиної думки про тiм, наскiльки реплiкацiя вiрусу зв'язана з процесами ушкодження печiнки i виходом вiрусних часток у периферичну кров [De Moliner, 1998. Marcus, 1994]. За даними Marcus с соавт. [1998, 1999], що використовували напiвкiлькiсний метод ПЛР, немає строгого зв'язку мiж вiрусною реплiкацiєю i рiвнем вiремiї. Згiдно отриманим нами даним, реплiкацiя вiрусу в печiнцi супроводжується бiльшою частотою виявлення РНК ВГС у сироватцi кровi, однак достовiрної кореляцiї мiж цими параметрами не виявлено. Невiдповiднiсть мiж кiлькiстю виявлених геномної i репликативної форм РНК ВГС у печiнцi i рiвнем вiремiї може бути наслiдком ряду причин:
1 - елiмiнацiї вiрусу iз сироватки за допомогою специфiчних антитiл;
2 - надходження ВГС у периферичну кров не тiльки з печiнки, але i з iнших органiв i тканин;
3 - порушення процесу вивiльнення вiрусу з клiток печiнки пiд дiєю лiкарських чи засобiв iнших факторiв [Marcus, 1994].
Досвiди, проведенi в нашiй лабораторiї, не виявили достовiрної кореляцiї мiж частотою зустрiчаємостi негативна-РНК ВГС у печiнцi i ступенем поразки печiночної тканини [Лакина, 2000]. Це погодиться з припущенням, що вiрус може реплицироваться, не викликаючи серйозних ушкоджень у тканинi печiнки. Однак є данi про можливу участь вiрусної реплiкацiї в розвитку цитопатичного ефекту [Chang, 2000, Tsutsumi, 1994]. За допомогою методу гiбридизацiї in situ показано, що клiтки, що мiстять репликативную форму РНК вiрусу, локалiзованi переважно у вогнищах поразки печiнки [Tsutsumi, 1994]. Виявлено достовiрну кореляцiю мiж кiлькiстю гепатоцитiв.
1. 4 Епiдемiологiя i клiнiка
Джерелом iнфекцiї є тiльки людина. Поширення вiрусу вiдбувається трансфузiонно при переливаннi кровi i її чи препаратiв iнструментальним шляхом у результатi занесення зараженої вiрусом кровi в органiзм здорових людей, а також вертикально - вiд матерi до плоду. Сприйнятливiсть населення до ВГС дуже високого. За даними ВООЗ на 1997 рiк, на частку гепатиту С в Африцi приходиться до 25% усiх випадкiв вiрусного гепатиту. У рядi країн Америки - до 35%. У США - до 90% посттрансфузiйного вiрусного гепатиту викликається вiрусом гепатиту С. Пiдтримцi епiдемiологiчного процесу сприяє схильнiсть гепатиту С к хронiчному плину. Вiрус видiляється вiд хворих протягом однiєї чи декiлькох тижнiв до появи ознак хвороби i до 10 тижнiв пiсля початку хвороби. Інкубацiйний перiод у порiвняннi з гепатитом B, коротше приблизно на 1 мiсяць i складає 6-8 тижнiв. Нерiдке захворювання протiкає без жовтяницi; остання спостерiгається приблизно в 25% хворих. Незважаючи на вiдносно сприятливий плин, близько 50% усiх форм iнфекцiї приводять до формування хронiчного гепатиту, а близько 20% хронiчних поразок печiнки закiнчуються цирозом i раком [Коротяев, 2000].
Вiрус гепатиту С - це найбiльш часта причина гострих вiрусних гепатитiв у людей похилого вiку. Серед усiх вiрусних гепатитiв, що уражали людей похилого вiку в США, Ізраїлi i Францiї, гепатит у спостерiгався в 74%, 72% i 60% випадкiв, вiдповiдно. Головним фактором ризику зараження гепатитом С у людей похилого вiку є проведенi ранiше гемотрансфузiї.
закiнчується розвитком хронiчного гепатиту С можливим переходом у цироз i первинний рак печiнки. Ранiше Гепатит С позначали термiном "Гепатит НІ-А-НІ-В [Sonnenblick, 1990].
Однiєї з основних характеристик гепатиту С є часта хронiзация. Вважається, що 60-70% гострого гепатиту С закiнчуються розвитком хронiчного гепатиту. Перехiд гострого гепатиту С в хронiчний вiдбувається поступово. Протягом декiлькох рокiв наростає активнiсть патологiчного процесу i фiброзу печiнки. Показники активностi сироваткових трансамiназ у межах чи норми незначно пiдвищенi. Показники синтетичної функцiї печiнки (кiлькiсть загального бiлка й альбумiну) у межах норми, аж до розвитку цирозу печiнки. До факторiв, що визначають розвиток хронiчного гепатиту, може бути вiднесений вiк захворiлого гострим гепатитом С [Львов, 1997].
Для хронiчного гепатиту С характерно наявнiсть у печiнцi лiмфоїдних iнфiльтратiв; iснування пацiєнтiв iз ВГС-вiремiей, але з нормальними показниками сироваткових трансамiназ, якi реєструються тривалий час. Крiм цього, висловлюється припущення, що в поразцi печiнки може вiдiгравати роль пiдвищений рiвень вiдкладення залiза в клiтках печiнки [Шахгильдян, 1999].
Патоморфологiчно гепатит С характеризується загальними проявами запалення i некрозу. Разом з тим, на вiдмiну вiд гепатиту В чи А, а також гепатитiв невiрусної етiологiї, для гепатиту С, характернi такi гiстологiчнi ознаки як: наявнiсть у портальних трактах щiльних лiмфоцитарних агрегатiв i фолiкулiв; интраваскулярнi синусоїдальнi iнфiльтрати чи лiмфоцитiв гиперплазiрованних Купфферовскiх клiтин при вiдсутностi вираженого некрозу гепатоцитов у безпосереднiм оточеннi; змiнений епiтелiй жовчних проток; жирова дистрофiя. Разом з тим, необхiдно враховувати, що спектр ушкодження печiночних клiтин при гепатитi С може бути надзвичайно широкий [Кузин, 1999].
печiнки, пiдвищення активностi сироваткових трансамiназ (у 2-3 рази), що змiнюються перiодами їхньої нормалiзацiї. У перiод клiнiчно виражених симптомiв захворювання хворий вiдзначає стомлюванiсть, млявiсть, нездужання, зниження працездатностi, поганий сон, почуття ваги в правому пiдребер'ї. У 40-45% випадкiв реєструють внепечiночну прояву захворювання. Вважають доведеним, що змiшана крiоглобулiнемия асоцiйовано з хронiчним гепатитом С. Вона реєструється в 42-96% випадкiв, а в 10-42% має клiнiчнi прояви: слабiсть, артралгiя пурпуру, синдром Рейно, артерiальна гiпертонiя, поразка бруньок. До складу крiопреципiтата можуть входити РНК ВГС, антитiла до бiлок кодованих структурною i неструктурною частиною геному ВГС. У якостi iнших внепечiночних проявiв хронiчної ВГС-инфекции розглядають: ендокриннi (гiпертиреоз, гипотиреоз, тиреоидит Хашимото); гематологiчнi (iдеопатична тромбоцитопенiя, неходжкiнская В-лимфома, апластична анемiя та iн.); поразка слинних залоз i око (лiмфоцитарний сiалоаденит, виразки роговицi, увеiт); шкiрнi (пiзня шкiрна Порфирiя, червоний плоский лишай, вузлувата еритема та iн.); нейромишечнi i суглобнi (мiопатичний синдром, синдром Гiйена-Барре й iн.); нирковi (гломерулонефрит); автоiмуннi (вузликовий перiартерiiт). У бiльшостi випадкiв внепечiнковi прояви реєструються в пацiєнтiв, схильних до аутоiмунних реакцiй. В даний час також прийнято вважати iнфiкування вiрусом гепатиту С причиною розвитку гепатоклiтиної карциноми [Львов, 1997].
Рiдким ускладненням гострого гепатиту С є фульмiнантний гепатит при ретроспективних дослiдженнях знайшли, що в хворих фульмiнантним гепатитом у вiк вище 50 рокiв є незалежним прогностичним фактором [Hoofnagle, 1995].
Вiрусний Гепатит С часто приводить до хронiчного захворювання печiнки, i принаймнi в 50% хворих розвивається хронiчний гепатит. У тих, у кого виникає хронiчний гепатит, у 20 - 60% (данi залежать вiд тривалостi спостереження) розвивається цироз печiнки [Покровский, 1993].
У хворих хронiчним гепатитом С похилого вiку титр РНК HCV значно вище такого в молодих пацiєнтiв. Вiрусом гепатиту С часто заражаються в старшому вiцi, тому в багатьох лiтнiх людей спостерiгається активна реплiкацiя вiрусу, при тiм що цироз печiнки ще не встигає розвитися. Для порiвняння: вiрусом гепатиту В часто заражаються в дитинствi i юностi, тому в людей похилого вiку не спостерiгається активної реплiкацiї вiрусу, а цироз до цього часу вже розвивається. Знижена здатнiсть iмунної системи лiтнiх справитися з вiрусом гепатиту С пояснює бiльш високу в порiвняннi з молодими хворими вiремiю. Іншим можливим поясненням може служити той факт, що люди похилого вiку, як правило, уражаються ВГС типу 1Б, а в заражених вiрусом такого типу спостерiгається пiдвищений, у порiвняннi з iншими типами вiрусу, рiвень РНК ВГС у сироватцi. Ще одне можливе пояснення полягає в тiм, що в обстежуваних хворих вiрусним гепатитом С похилого вiку виявляється бiльш важке в порiвняннi з молодими захворювання печiнки. А титр РНК ВГС збiльшується з вагою хвороби печiнки [Кузин С. Н., 1999].
При постановцi дiагнозу "гепатит С" необхiдно враховувати наступнi найбiльш важливi фактори:
показники активностi печiнкових ферментiв;
наявнiсть чи вiдсутнiсть маркерiв iнфiкування вiрусом гепатиту С (ВГС) i iншими гепатотропними вiрусами;
данi епiдемiологiчного анамнезу;
результати клiнiчного обстежання пацiєнта.
Тiльки комплексний облiк даних факторiв дозволяє з високим ступенем надiйностi дiагностувати це захворювання (Laverdant, 1989).
Це дає можливiсть:
виявити осiб з наявнiстю ВГС для зниження рiвня посттрансфузiонного гепатиту С;
постановка дiагнозу i розмежування гострого i хронiчного гепатиту С;
прогноз захворювання;
призначення, оцiнка i прогноз ефективностi проведеної терапiї;
вивчення широти поширення ВГС у популяцiї i рiзних групах населення.
Основою лабораторної дiагностики гепатиту С є знання про ВГС, його реплiкацiї, iнформацiя про динамiк появи i зникнення маркерiв iнфiкування, а також сучаснi iмунохiмiчнi i молекулярно-бiологiчнi методи детекцiї антигенiв, антитiл i нуклеїнових кислот. (Yuasa, 1991)
"Chiron Corporation" пiд керiвництвом Q-L. Choo здiйснила клонування РНК ВГС i одержала iмунореактивнi олiгопептиди, що вступають у реакцiю з антитiлами, що циркулюють у кровi хворих хронiчним гепатитом "нi А, нi В". Цi олiгопептиди стали основою дiагностичних препаратiв для виявлення антитiл до ВГС (Лакина, 2000)
КОНФОРМАЦІЙНІ ТЕСТИ. Для розмежування ложнопозитивних зразкiв i зразкiв, дiйсно утримуючi антитiла до ВГС, розробленi додатковi (Supplemental) тести. Найбiльше часто в цих тестах використовується принцип iмуноблота, коли на нiтроцеллюлозной мембранi адсорбуються у видi окремих смуг антигени, кодованi рiзними зонами РНК ВГС. Анти-ВГС взаємодiють з адсорбованими антигенами за допомогою мiчених ферментом антитiл проти Іg людини з наступної їх детекцiею за допомогою субстратного комплексу (Prince, 1996).
ВИЗНАЧЕННЯ Іg АНТИ- ВГС. В даний час створенi i промислово випускаються дiагностичнi набори для виявлення Іg анти-ВГС На етапi конструювання дiагностичних наборiв були створенi набори для ИФА, основою яких були пептиди, кодованi рiзними регiонами РНК ВГС. Вибiр був зупинений на пептидi, кодованому Core регiоном РНК ВГС i виявленнi антитiл до нього класу Іg (Исаева, 2001)
ВИЗНАЧЕННЯ АНТИГЕНІВ ВГС. Можливiсть визначення антигенiв ВГС привертала увагу дослiдникiв вiдразу ж пiсля вiдкриття вiрусу. Принципова можливiсть їхнього тестування була продемонстрована К. Krawczynski зi спiвавторами, що iмуногiстохiмiчно знайшли в печiночнiй тканинi антигени ВГС, довiвши специфiчнiсть iмунофлюоресцентного випромiнювання. Застосування поли- i моноклональних антитiл до рiзних антигенiв ВГС установило наявнiсть ВГС core Ag, антигенiв, кодованих NS3 i NS4 зонами РНК ВГС, у ядрi i цитоплазмi гепатоцитiв, у 60-90% хворих хронiчним ВГС. Однак подальшi дослiдження продемонстрували, що антигени ВГС удається знайти менш чим у 5% печiночних клiтин (Букринская, 1996).
Установленi:
специфiчнiсть виявлення Core Ag ВГС;
наявнiсть осiб з циркулюючим антигеном у кровi серонегативних по анти-ВГС;
часте (90,3%) виявлення Core Ag ВГС у сироватках кровi з наявнiстю анти-ВГС i РНК ВГС;
пряма кореляцiя мiж концентрацiєю РНК ВГС i виявленням Core Ag ВГС;
Визначено, що Core Ag ВГС удається виявляти в 83% випадкiв (n=24) наступного дня пiсля першого виявлення РНК ВГС i задовго (у середньому 26 днiв) до появи анти-ВГС.
МЕТОДИ ВИЯВЛЕННЯ РНК ВГС. Сучасний етап лабораторної дiагностики гепатиту С можна охарактеризувати як етап початку широкого застосування молекулярно - бiологiчних методiв виявлення РНК ВГС. Переважна бiльшiсть методiв виявлення нуклеїнових кислот було апробовано для виявлення РНК ВГС. Принципам конструювання дiагностичних препаратiв i їхньому застосуванню для детекцiї вiрусних ДНК чи РНК присвячене значна кiлькiсть лiтературних оглядiв, опублiкованих як у вiтчизняних, так i закордонних виданнях. Усi цi методи можна роздiлити на двох груп, в основi яких лежить застосування принципiв гiбридизацiї без амплiфiкацiї обраної дiлянки нуклеїнової кислоти та з їх амплiфiкацiєю, що дозволяє значно пiдвищити здатнiсть методу.
МЕТОД ГІБРИДИЗАЦІЇ заснований на з'єднаннi мiчених гiбрiдiзацiонних зондiв (генноiнженернi чи синтетичнi молекулярнi структури, що мiстять у собi нуклеотиднi послiдовностi, комплементарнi обраним дiлянкам РНК). Облiк результатiв здiйснюють по iнтенсивностi сигналу, що надходить вiд мiтки в складi комплексу, що утворився.
При гепатитi С цей метод виявлення РНК ВГС насамперед знайшов застосування для її iдентифiкацiї безпосередньо в гепатоцитах, у тестах що позначаються - in situ hibidization. Можливiсть безпосередньої детекцiї РНК ВГС у тканинi дозволила знайти її в мононуклеарних клiтках кровi, клiтках слинних залоз i iнших тканин органiзму хворого гепатитом С (Моминалиев, 2000).
МЕТОД ГІБРІДІЗАЦІЇ, ЯКИЙ ЗАСТОСОВУВАЛИ ДЛЯ ДЕТЕКЦІЇ РНК ВГС, дозволяє продемонструвати наявнiсть негативних (реплiкативних) ланцюгiв РНК ВГС, що свiдчить про активну реплiкацiю вiрусу.
Метод полiмеразної ланцюгової реакцiї - у даний час найбiльш широко застосовуваний методичний прийом, що лежить в основi практично всiх молекулярно-бiологiчних методiв детекцiї РНК ВГС. Причому, визначення РНК ВГС можливе як у якiсному, так i кiлькiсному варiантi, що особливо важливо для призначення, монiторингу й оцiнки ефективностi застосовуваної терапiї.
Як основнi варiанти методу можна видiлити:
лiгазну ланцюгову реакцiю;
NASBA;
кожен цикл складається з послiдовних етапiв.
З дослiджуваного матерiалу (сироватка, плазма кровi, печiнковий бiоптат) видiляється РНК ВГС. З огляду на те, що нуклеїнова кислота ВГС представлена РНК, а для амплiфiкацiї необхiдна молекула кДНК, за допомогою ферменту - зворотної транскриптази, вiдбувається утворення одноланцюгових молекул кДНК ВГС. На наступному етапi до визначеної дiлянки кожного з ланцюгiв кДНК ВГС приєднуються т. з. праймери - короткi олiгонуклеотиди, комплементарнi вiдомим нуклеотидним послiдовностям. Порiвняння первинної структури 5'UTR областi геному рiзних iзолятiв ВГС виявило їхню незначну мiнливiсть (мiж генотипами, гомологiя нуклеотидiв - 92-98%, а у серединi генотипу 98-99%).
Далi, за допомогою ферменту ДНК-залежної ДНК полiмерази вiдбувається синтез нових дiлянок ДНК. В даний час як джерело цього ферменту найчастiше використовують бактерiї Thermophilus termus (Tth-полiмераза) чи Thermophilus aquaticus (Taq-полiмераза). Володiючи термостабiльнiстю в присутностi iонiв марганцю i магнiю, цей фермент може бути одночасно використаний для синтезу комплементарних одноланцюгових молекул кДНК ВГС i амплiфiкацiї обраних дiлянок кДНК. На завершальному етапi одного циклу реакцiї, за допомогою ДНК полiмерази вiдбувається синтез нових ланцюгiв комплементарних кДНК ВГС. Багаторазове повторення циклiв реакцiї призводить до накопичення фрагментiв кДНК ВГС, що можливо зареєструвати за допомогою електрофорезу в полiакриламiдному гелi з наступною вiзуальною детекцiєю чи iз застосуванням гiбридизацiї з олiгонуклеотидними зондами, що збiльшує чутливiсть i специфiчнiсть застосовуваних дiагностичних препаратiв. Застосування праймерiв, мiчених ферментами, дозволяє проводити облiк результатiв ПЛР за допомогою iмуноферментного аналiзу.
ЛІГАЗНА ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ виявлення РНК BГ.(LCR).
Метод заснований на здатностi ферменту "ДНК- залежної ДНК-лiгази" зшивати (лiгувати) розриви фосфодiефiрного зв'язку в ДНК у присутностi АТФ i iонiв Mg2+. Так само як i при проведеннi "класичної" ПЛР для виявлення РНК ВГС, перший етап LCR - зворотна транскрипцiя з одержанням кДНК ВГС. Далi ДНК-лiгаза здiйснює зв'язування двох пар праймерiв (комплементарних 5' некодованiй зонi РНК ВГС), що надалi амплiфiкуються. Детекцiя продуктiв амплiфiкацiї LCR здiйснюється за допомогою облiку реакцiї антитiло-антиген-антитiло. Кожний iз двох праймерiв мiтиться рiзним гаптеном. Перший з них захоплюється антитiлами, адсорбованими на мiкрочастинках. Пiсля процедури промивання за допомогою другої пари антитiл, мiчених флуоресцентною мiткою, вiдбувається їхня виборча взаємодiя з гаптеном в амплiфiкацiйному продуктi з наступним проведенням субстратної реакцiї й облiком на флюориметрi.
Чутливiсть цього методу складає близько 200 копiй РНК ВГС у мл, що дозволяє його використовувати для рiшення рiзних клiнiко-дiагностичних задач.
NUCLEІC ACІDS SEAQUENCENCE AMPLІFІCATІON - NASBA - метод детекцiї РНК ВГС заснований на одночаснiй дiї трьох ферментiв: зворотної транскриптази вiрусу мiєлобластоми птахiв, РНК-ази Н и РНК-полимерази Т7. На вiдмiну вiд RT PCR на першому етапi не проводиться зворотна транскрипцiя РНК ВГС. За допомогою використаних ферментiв вдається одержати бiльш 109 копiй дiлянки кДНК ВГС протягом 90 хвилин. Можливiсть проведення реакцiї при невеликих температурах (+41 С) значно спрощує роботу i дозволяє вiдмовитися вiд устаткування, що забезпечує циклiчнi змiни високих температур. Облiк результатiв реакцiї здiйснюється за допомогою електрохемiлюмiнiсценцiї. Незважаючи на те, що по своїй чутливостi NASBA близька до RT PCR, метод широко не використовується для виявлення РНК ВГС. В даний час проводиться розробка варiанту методу, що сполучить принципи проведення NASBA i "Real-time RT PCR".
КІЛЬКІСНЕ ВИЯВЛЕННЯ РНК ВГС. Для оцiнки концентрацiї РНК ВГС застосовують кiлькiсний варiант ПЛР. Спочатку концентрацiю РНК ВГС намагалися охарактеризувати порядковими величинами, наприклад "+","++" i т. д., що вiзуально вiдбивають iнтенсивнiсть смуг, отриманих при електрофорезi продуктiв амплiфiкацiї, чи ж методом кiнцевих розведень, по наявностi позитивного результату в кiнцевiй крапцi титрування. Труднощi стандартизацiї всiх етапiв ПЛР не дозволяють об'єктивно оцiнити концентрацiю РНК ВГС, що приводить до iстотних помилок трактування отриманих результатiв [Масалова, 2000].
РНК ВГС вiдбиває кiлькiсть вiрусних часток, даний показник позначають як "вiрусний еквiвалент (eq)", з додаванням приставки k (кiлограм, тисяча) чи М (мiльйон). Ще одним способом вираження кiлькостi вiрусних часток є їхнi ваговi еквiваленти. Комiтет експертiв ВООЗ по бiологiчнiй стандартизацiї виготовив "мiжнародний стандартний зразок", що мiстить РНК ВГС (лiофiльно висушена сироватка кровi, що мiстить РНК ВГС 1-го генотипу), концентрацiя якої виражена в мiжнародних одиницях (ІU/m).
Спецiальнi коефiцiєнти дозволяють перераховувати отриманi показники концентрацiї в мiжнароднi одиницi.
Для визначення концентрацiї РНК ВГС застосовують практично усi варiанти ПЛР. При цьому до дiагностичних препаратiв пред'являється ряд специфiчних вимог, найважливiшим з який є лiнiйнiсть результатiв, тобто збiльшення сигналу реєстрованої реакцiї при збiльшеннi концентрацiї РНК ВГС у дослiджуваному зразку. Застосування внутрiшнiх стандартiв з рiзним вмiстом РНК ВГС дозволяє уникнути багатьох методичних помилок, що можуть вiдбитися на кiнцевому результатi реакцiї.
ПЛР У РЕАЛЬНОМУ ЧАСІ ("Real-time RT PCR") - один з найбiльш перспективних варiантiв кiлькiсного методу виявлення РНК ВГС. Принцип методу полягає в здатностi гiдролiзувати послiдовностi кДНК у напрямку 5'-i-i 3'. У реакцiї застосовується спецiальний зонд, мiчений двома флуоресцентними барвниками, що мають близькi максимуми поглинання i флюоресценцiї. При наявностi продуктiв амплiфiкацiї Tag-полiмераза розщеплює зонд, що приводить до запобiгання переносу енергiї вiд однiєї молекули барвника до iнший, i тим самим запобiгає вихiду кванта свiтла. Спецiальний прилад здiйснює облiк реакцiї i математичне моделювання кiнетики флюоресценцiї на кожнiм етапi реакцiї, що дозволяє одержати iнформацiю про вихiдну концентрацiю РНК ВГС.
Вiдмiнною рисою "ПЛР у реальному часi" вважають можливiсть одержувати iнформацiю про наявнiсть РНК ВГС безпосередньо в процесi реакцiї, що дозволяє зменшити час аналiзу в сполученнi з високою чутливiстю i лiнiйнiстю одержуваних результатiв. [Bukh, 2000].
iнфекцiї пiд час спалахiв гепатиту С чи прогнозування ефективностi застосовуваної терапiї.
"Золотий стандарт" генотипування ВГС - безпосереднє визначення первинної структури РНК ВГС iз його наступним фiлiпченковим аналiзом, що дозволяє чiтко охарактеризувати даний iзолят вiрусу [Kondo, 1993].
Незважаючи на точнiсть одержуваного результату, метод безпосереднього секвенирування не використовується в практичнiй охоронi здоров'я через технiчнi складностi проведення дослiдження i високої вартостi робiт. Разом з тим наявнiсть iнформацiї про первинну структуру РНК ВГС є референтним методом генотипування, а наявнiсть приладiв для автоматичного секвенирування спрощує одержання результату. В даний час у бiльшостi випадкiв для генотипування РНК ВГС застосовуються методи, заснованi на використаннi ПЛР iз типоспецифiчними праймерами. Гiбридизацiя амплiфiкованих продуктiв iз адсорбованими геноспецифiчними зондами (з 5'-нетрансльованої зони РНК ВГС), адсорбованими на нiтроцелюлознiй мембранi.
Методичний арсенал визначення генотипiв ВГС не обмежується перерахованими вище способами i мiстить у собi рiзноманiтнi методи:
генотипування на основi аналiзу профiлiв рестрикцiї амплiфiкованих продуктiв. Продукти амплiфiкацiї фрагментiв РНК ВГС (NS5 область РНК ВГС) розщеплюються рестриктазами. Фрагменти, що утворилися, розрiзняються по довжинi в залежностi вiд наявних усерединi них сайтiв рестрикцiї, по яких йде розщеплення. Результати електрофорезу i їхнє порiвняння дозволяють iдентифiкувати генотип ВГС у дослiджуваному зразку. Порiвняння результатiв генотипування з даними секвенирування продемонструвало високий рiвень збiгу результатiв - 95% [Ильина, 2000].
варiацiй, що вiдрiзняють генотипи друг вiд друга. Цей факт визначає можливiсть застосувати загальнi праймери при генотипуваннi.
СЕРОТИПУВАННЯ Анти-ВГС стало можливим завдяки дослiдженням P. Simmonds зi спiвавторами, який встановив наявнiсть антитiл, спрямованих до генотипспецифiчних епiтопiв, iнформацiя про якi кодована NS4 зоною РНК ВГС.
Результати серотипування анти-ВГС свiдчать про типову приналежнiсть анти-ВГС при поточнiй чи ранiше перенесенiй iнфекцiї. У деяких випадках (найбiльше часто в хворих гемофiлiєю) реєструється одночасне виявлення анти-ВГС рiзних пiдтипiв, що може свiдчити про множинне iнфiкування рiзними субтипами i генотипами ВГС. Крiм того, у пацiєнтiв з гепатитом С на фонi вираженого iмунодефiцитного стану РНК можуть бути єдиним маркером, що унеможливлює проведення серотипування [Мукомолов, 1999].
1. 6 Лiкування
До недавнiх часiв кращим засобом проти ВГС вважався iнтерферон, цi лiки, що iнгибують реплiкацiю вiрусу. Медикаментозний iнтерферон, що використовується для лiкування гепатитiв включає: ІNFγ-2b (iнтрон-а), ІNFγ-2a (роферон-а) i ІNF alfacon-1 (iнферген). Але iнтерферони працюють тiльки в 20% випадкiв [Саринсон, 1998]. Зараз iн'єкцiї iнтерферону комбiнують з пероральним введенням рибавiрина (Виразол) - антивiрусний агент широкого спектра дiї. Лiкування звичайно триває вiд 6 мiс. до року, i є успiшним приблизно лише для 40% хворих [Goodson, 1992].
Недавнi дослiдження показали, що iншi лiки, пролонгований iнтерферон, є в 2 рази бiльш ефективним, нiж звичайний iнтерферон. У сiчнi 2001 року Харчове i Лiкарське Керування запропонували використання пролонгованого iнтерферону - γ-2В - для лiкування гепатиту С [Hoofnagle, 2001].
Вiдомо, що функцiї iнтерферону (ІFN) в органiзмi рiзноманiтнi, однак найбiльш важливої з них є антивiрусна, яка здiйснюється шляхом стимуляцiї вироблення антивiрусних бiлкiв у iнтактних клiтинах, що забезпечує в них розвиток т. н. антивiрусного стану [Григорян, 1990]. Унiкальнi властивостi ІFN з'явилися причиною активної розробки рiзних технологiй його виробництва i клiнiчного застосування. Незважаючи на успiхи ІFN-терапии i розширення спектра його застосування, iснує багато проблем, зв'язаних з цим видом лiкування. Частота порушень ІFN статусу, розширення представлень про спектр захворювань, при яких необхiдна терапiя препаратами ІFN, висока вартiсть, можливiсть виникнення ряду ускладнень вiд їхнього застосування, стимулювали дослiдження з вивчення iндукторiв ІFN.
Побiчний ефект вiд застосування лiкарської терапiї iнтерфероном мiстить у собi симптоми, схожi з грипом i тимчасове зниження вмiсту гемоглобiну в кровi (анемiя), лейкоцитiв i тромбоцитiв у кровi. Хронiчнi побiчнi ефекти - якi складають приблизно половину при прийнятому лiкуваннi iнтерфероном-рибавiрином - включають сильну втому, занепокоєння, дратiвливiсть i депресiю. Невеликий вiдсоток людей випробує психологiчнi чи суїцидальнi настрої. Вченi розробляють використання iнгiбiторiв протеаз для лiкування людей iз ВГС. Цi ж медикаменти використовуються для деяких людей, хворих СНІДом. У майбутньому можливе лiкування ВГС за допомогою генної терапiї. Найкраще лiкування для людей на кiнцевiй стадiї печiнкової хвороби (печiнкова недостатнiсть) є пересадження печiнки [Подимова, 1998].
Встановлено, що в рядi випадкiв застосування iндукторiв ІFN має переваги перед використанням екзогенних ІFN. Так, iндуктори ІFN стимулюють вироблення власних ІFN, що не володiють антигенностью. При цьому їхнiй синтез знаходиться пiд контролем ІЛ i бiлкiв-репресорiв i не досягає рiвня, здатного зробити дiю, що ушкоджує, органiзм. Індуктори ІFN розрiзняються по хiмiчнiй природi, по тому на якi клiтки-продуценти вони дiють, синтез якого виду ІFN вони викликають, а також за часом досягнення максимальної концентрацiї ІFN у сироватцi i тривалостi дiї препарату [Григорян, 1990].
Амiксин вiдноситься до класу флуоренiв i є низькомолекулярним iндуктором ендогенного iнтерферону.
топоiзомераза, зворотня транскриптаза. Про здатнiсть амiксина брати участь у моделюваннi iмунної системи можна судити за результатами, що свiдчать про активацiю NK [Григорян, 1990].
У зв'язку з недостатнiстю iнтерфероногенеза, що спостерiгається в хворих вiрусними гепатитами [Дидковский, 2000], у комплексному лiкуваннi гострих i хронiчних вiрусних гепатитiв перспективним є застосування iндукторiв синтезу iнтерферону [Івахiв, 2001, Малий 2001]. Одним з iндукторiв синтезу iнтерферону є циклоферон - низькомолекулярний iндуктор iнтерферону, що вiдноситься до класу акридонiв.
Циклоферон є низькомолекулярним iндуктором iнтерферону, що визначає широкий спектр його бiологiчної активностi (противiрусної, iмуномодулюючої, протизапальної, антипролiферативної, протипухлинної та iн.). Препарат iндукує синтез раннього a-типу-iнтерферону. У тканинах i органах, що мiстять лiмфоїднi елементи, циклоферон iндукує високий рiвень iнтерферону, що зберiгається протягом 72 годин. Основними клiтинами-продуцентами iнтерферону пiсля введення циклоферону є макрофаги, Т- i В-лiмфоцити. У залежностi вiд вихiдного стану має мiсце активацiя тiєї чи iншої ланки iмунiтету. Препарат iндукує високi титри альфа-iнтерферону в органах i тканинах, що мiстять лiмфоїднi елементи (селезiнка, печiнка, легенi), активує стовбурнi клiтини кiсткового мозку, стимулюючи утворення гранулоцитiв. Циклоферон активує Т-лiмфоцити i природнi кiлернi клiтини, нормалiзує баланс мiж субпопуляцiями Т-хелперiв i Т-супресорiв [Руденко, 2000, Романцев, 2000].
Циклоферон ефективний у вiдношеннi вiрусiв клiщового енцефалiту, грипу, гепатиту, герпесу, цитомегаловiрусу, вiрусу iмунодефiциту людини, вiрусу папiломи й iнших вiрусiв [Шостакович-Корецкая, 2000].
Імуномодулюючий ефект циклоферона виражається в корекцiї iмунного статусу органiзму при iмунодефiцитних станах рiзного походження й аутоiмунних захворюваннях.
Застосування циклоферона при лiкуваннi гострого i хронiчного вiрусного гепатиту С сприяло бiльш швидкому полiпшенню самопочуття хворих, вiдновленню апетиту, зникненню жовтяницi. Клiнiчному полiпшенню вiдповiдала позитивна динамiка бiохiмiчних i iмунологiчних змiн [Ершов , 1999, Солдогуб, 1999].
Аналiзуючи даннi наведенi в оглядi лiтератури слiд зазначити, що на даний час використання iмуномоделюючих препаратiв, таких як амiксин i циклоферон є найбiльш вдалим для лiкування ВГС. Тому вивчення їх дiї при лiкуваннi гепатиту С є доцiльним.
Нами проводилося дослiдження лiкувальної ефективностi застосування iмуномоделюючих препаратiв у хворих на хронiчний гепатит С. Данi отримували при вивченнi клiтинного, гуморального iмунiтету та бiохiмiчних тестiв у хворих, якi знаходилися на стацiонарному лiкуваннi у НІІ очних хвороб i тканинної терапiї iм.. В. П. Фiлатова.
Матерiалом для дослiдження була кров хворих на гепатит С.
2. 1 Визначення показникiв клiтинного iмунiтету
Визначення вмiсту лiмфоцитiв i лейкоцитiв у кровi
Зважили пробу, отриману в результатi з'єднання 0,008 мл кровi i 0,1 мл 10 % розчину оцтової кислоти в процесi забору кровi, ретельно перемiшали наконечником пiпетки i заповнили нею камеру Горяєва. Пiдрахували кiлькiсть лiмфоцитiв i лейкоцитiв (клiтки кровi чiтко розрiзнялися за формою ядра (у 20 великих квадрантах iз застосуванням об'єктива х40).
де Лей — вмiст лейкоцитiв у кровi, тис/мкл
Горяева.
Лi = К*б /1000
де Лi — вмiст лiмфоцитiв у кровi, тис/мкл
б — кiлькiсть лiмфоцитiв, у 20 великих квадрантах камери Горяєва.
К — коефiциєнт перерахунку: тут К= 169.
Визначення комплексу показникiв розеткоутворення i фагоцитозу
Приготування суспензiї лейкоцитiв
Лейкоцити, що мiстяться в суспензiї, отриманої в результатi лiзису еритроцитiв у процесi забору кровi, осадили центрифугуванням планшета при 200 д протягом 5 хв., надосадкову рiдину злили iз планшета. До отриманого осаду лейкоцитiв долили 0,2 мл середовища 199, i одержали суспензiю лейкоцитiв, яку використали для постановки комплексу тестiв розеткоутворення i фагоцитозу.
Постановка реакцiї розеткоутворення i фагоцитозу
Реакцiї розеткоутворення i фагоцитозу ставили у 96-лункових планшетах для iмунологiчних реакцiй однократного застосування, що мали лунки обсягом 0,2 мл iз круглим дном. Для герметизацiї в кришку планшета вкладали полiетиленову прокладку, яка вирiзувалася з упакування планшета. Кришку закрiплювали на планшетi за допомогою резинки.
Е- розеткоутворення (Т-лiмфоцити)
У лунку планшета заливали 0,05 мл отриманої суспензiї лейкоцитiв. Доливали 0,05 мл 0,1 % суспензiї еритроцитiв барана. Центрифугували при 200 д протягом 5 хв., потiм iнкубували при +4°С протягом 30 хв.
Тест М- розеткоутворення ставили так само, як тест Е- розеткоутворення, але замiсть суспензiї еритроцитiв барана доливали 0,05 мл 0,1 % суспензiї еритроцитiв мишi.
Д-фагоцитоз нейтрофiлiв
Тест Д-фагоцитоза нейтрофiлiв ставили також, як тест Е- розеткоутворення, але замiсть суспензiї еритроцитiв барана доливали 0,06 мл 0,1 % суспензiї клiток пекараських дрiжджiв, вбитих нагрiванням.
Е-розеткоутворення пiсля iнкубацiї клiток з теофiлiном
(теофiлiн-резистентнi Е- розеткоутворюючi лiмфоцити - субпопуляцiя, збагачена клiтками, що володiють хелперною активнiстю)
У лунку планшета заливали 0,05 мл отриманої суспензiї клiток, доливали 0,05 мл 0,01 М розчину теофiлiну в середовищi 199. Інкубували при 37 °С протягом 1 години. Далi доливали 0,05 мл 0,1 % суспензiї еритроцитiв барана i ставили реакцiю Е- розеткоутворення.
Фiксацiя i приготування мазкiв
Пiсля iнкубацiї осаду при + 4 +10°С у лунки обережно, так щоб не зашкодити осад, додавали 0,02 мл фiксатора, приготовленого на основi глутарового альдегiду. Витримували при кiмнатнiй температурi протягом 5 хвилин. Пiсля цього надосадкову рiдину видаляли одночасно з усiх лунок планшета швидким iнтенсивним струшуванням. Потiм у кожну лунку негайно додавали по 0,05 мл дистильованої води. Осад ресуспендировали у процесi готування мазкiв. Мазки готували на ацетатцелюлознiй плiвцi у видi краплi, що займає квадрат розмiром 9X9 мм. На поверхнi прямокутної плiвки розмiром 90X130 мм мiститься 96 мазкiв.
Висушенi мазки фiксували у метанолi протягом 10 хвилин (чи абсолютному етанолi протягом 20 хвилин). Потiм помiщали у розчин метилового зеленого - пiронiна. Через 30 хв. мазки виймали, змивали водою, промокали фiльтрувальним папiром i сушать у розправленому станi мiж аркушами фiльтрувального папера пiд вантажем. На висушену плiвку наносять тонким шаром розчин канадського бальзаму в ксилолi i накривали ацетатцелюлозною плiвкою такого ж розмiру, яку щiльно притискали. Отримана плiвка з 96 препаратами готова до мiкроскопiї. При вiдсутностi метилового зеленого - пiронiна мазки можна фарбувати азуреозином при РН 5-6 протягом 10 хв.
Пiдрахунок кiлькостi розеткоутворюючих i фагоцитуючих клiток
У препаратах перераховується число розеткоутворюючих лiмфоцитiв на 50 лiмфоцитiв i кiлькiсть фагоцитуючих нейтрофiлiв на 50 нейтрофiлiв iз застосуванням об'єктива Х40, при правильному настроюваннi свiтла в мiкроскопi по Келлеру. Можна додатково прораховувати в цих препаратах кiлькiсть розеткоутворюючих нейтрофiлiв. За розеткоутворюючу клiтку вважали таку клiтку, до якої прикрiпилося 3 i бiльша кiлькiсть еритроцитiв. За фагоцитуючу вважати клiтку-нейтрофiл, що захопив 1 чи бiльшу кiлькiсть дрiжджових клiток. Обчислювали % розеткоутворюючих i фагоцитуючих клiток.
Визначення абсолютного вмiсту розеткоутворюючих клiток у 1 мкл кровi
Е-РУЛ тис/мкл = Лi тис/мкл * Е - РУЛ / 100%
М-РУЛ тис/мкл = Лi тис/мкл * М - РУЛ / 100%
де, Е-РУЛ - Е- розеткоутворюючi лiмфоцити, вiдповiдно тис/мкл, %;
Визначення кiлькостi теофiлiн-чутливих Е-РУЛ
ЕТФ-Ч-РУЛ = Е РУЛ - ЕТФ-Р-РУЛ
де, Е-РУЛ - кiлькiсть розеткоутворюючих лiмфоцитiв (спонтанних), %;
ЕТФ-Р-РУЛ - кiлькiсть теофiлiн-резистентних Е-РУЛ;
Постановка комплексу тестiв розеткоутворення i фагоцитозу
за допомогою крапельниць. Пiсля цього в планшети вносять вiдповiднi реактиви, i пiсля постановки реакцiї готували мазки. Усi реактиви вносять у лунки планшетiв за допомогою крапельниць. Мазки залишали до повного висихання. Висушенi мазки фiксували у метанолi.
Визначення цитотоксичної активностi НК-клiтин
Отримували клiтини мiшеней.
Вiдмивали у средi i розводили до концентрацiї 106, 5*105, 105 кл/мл для спiввiдношення клiтина-ефектор – клiтина-мiшень = 1:10, 1:50, 1:100 вiдповiдно.
Постановка реакцiї:
Активнiсть НК (цитотоксичнiсть) вимiрюють мiкроскопiчним методом. У пластиковi камери з плоским дном, вносять 0,1 мл дослiджуємих клiтин, по 0,1 мл клiтин мишей i культивують при 37оС у вологiй камерi з 5% СО2 протягом 4-16 годин. В контрольну лунку вносили клiтини-мiшенi i використовували живiльне середовище.
Оцiнка реакцiї:
Пiсля культивування пiдраховували кiлькiсть непошкоджених клiтин у камерi Горєва.
Індекс цитотоксичностi визначали по формулi:
ІЦ=100%*а-в/а
в – кiлькiсть еритроцитiв у середовищi з ефекторами
Приготування 10-кратного розчину Хенкса
На 1 л розчину беруть NaCl 80,0 г
КС1 4,0 г
MgS04*7H20 2,0 г
CaCI*6H2O 2,75 г
КН2Р04 0, 6 г
Na2HPO4*2H20 1, 53 г
Глюкоза 10, 0 г.
Розливали у невеликi щiльно закритi ємностi i зберiгали у замороженому станi.
Приготування суспензiї еритроцитiв барана та мишей
2 - 3 рази). Для готування суспензiї 0,01 мл вiдмитого залишку еритроцитiв змiшували з 10 мл середовища 199. Суспензiю зберiгали при температурi + 4 +10°С не бiльш трьох годин, перед використанням збовтували.
Кров мишi безпородної беруть у пробiрку з гепарином, Вiдмивали i готували так само, як i суспензiю еритроцитiв барана. Збереження таке ж, як суспензiї барана.
Суспензiя клiтин пекарських дрiжджiв
Лiофiлiзованi чи свiжi пекарськi дрiжджi розводять у фiзрозчинi (спiввiдношення 1:5 ) i витримували у киплячiй водянiй лазнi протягом 60 хвилин. Зберiгали при температурi О- 4°С до 12 мiсяцiв. Перед постановкою реакцiї дрiжджi вiдмивали розчином Хенкса в тiм же режимi, що й еритроцити доти, поки рН надосадкової рiдини не буде 7,2-7,4 (тобто поки розчин буде зберiгати свiй колiр). Суспензiю клiток дрiжджiв готували i використовували так само, як суспензiю еритроцитiв.
Визначення вмiсту iмуноглобулiнiв
Імуноглобулiни класiв А, М, G - визначали у плазмi кровi методом радiальної iмунодифузiї в гелi в модифiкацiї методу Манчiнi.
Одержання плазми
Планшет-штатив, що мiстить пластмасовi трубочки зi зразками кровi, центрифугували при 200° 10 хвилин. Верхню частину трубочки, що мiстить плазму, зрiзували i переносять в iнший аналогiчний штатив у тiм же порядку. Отриману плазму можна тривало зберiгати в замороженому станi. Перед постановкою реакцiї плазму разморажували i переносять у лунки планшета, де розводять фiзiологiчним розчином у 3 рази (спiввiдношення плазма - фiзрозчин 1:2).
На кришку 96-лункового планшета, що лежить на нагрiвальнiй пiдставцi (температура 50 °С) у строго горизонтальному положеннi, наливали 16 мл розчину агару, що мiстить моноспецифiчну сироватку до iмуноглобулiнiв визначеного класу. Пiсля охолодження на кришцi виходить рiвний шар гелю. У цьому шарi пробiйником вирiзували лунки дiаметром 2 мм вiдповiдно до розмiру лунок стандартного 96-ямкового планшета. Таким чином, на пластинi одержували 96 лунок.
Розчин агару, що мiстить моноспецифiчну сироватку, готували таким чином: у першу чергу готували розчин, що мiстить 1,2 % агару, 2 % полiетиленглiколя (м. в. 6000) i 0,01 % мертiолата, iнше - фiзiологiчний розчин. Нагрiвали його до 50 °С при перемiшуваннi, пiсля чого доливали антiсироватку, щоб кiнцева концентрацiя її в розчинi вiдповiдала зазначеної на ампулi.
Постановка реакцiї
У лунки першого ряду пластини, покритої шаром гелю, вносять стандартну сироватку нерозведену й у розведеннях 1:2, 1:4, 1:8 у такiй кiлькостi, щоб вона заповнила лунку до рiвня агару (орiєнтовно 3-4 мкл). Лунки iнших рядiв заповнювали зразками випробуваної плазми в розведеннi 1:2. Далi пластини iнкубували при 37 °С у вологiй камерi для визначення рiвня ІgG протягом 4-6 годин, ІgA - протягом 12-24 годин, ІgM - 24- 28 годин. Інкубацiю припиняли тодi, коли розмiри кiлець преципiтацiї стандартних сироваток будуть достатнi для упевненого вимiру дiаметрiв. Для створення вологої камери зручно використовувати герметично закритий полiетиленовий пакет, на дно якого кладуть вiдпрацьований 96-луночний планшет, лунки якого наповненi водою.
По закiнченнi iнкубацiї на пластинах замiряли дiаметри кiлець, преципiтацiї за допомогою окуляра-мiкрометра в лупi МБС-9 з пiдсвiтом через увiгнуте дзеркало, у центрi якого знаходиться чорне коло, чим створюється ефект "темного поля", що рiзко збiльшує контрастнiсть краю преципiтату в агарi.
Побудова калiбровочної кривої i визначення змiсту iмуноглобулiнiв
Вмiст iмуноглобулiнiв у випробуванiй плазмi визначали калiброваною кривою, яку будували на напiвлогарифмiчному паперi таким чином: по осi абсцис вiдкладали дiаметри кiлець стандартної сироватки. По осi ординат - вiдома кiлькiсть iмуноглобулiнiв, що мiстяться у вiдповiдному образi стандартної сироватки, помножене на 3. Отриманi крапки з'єднували. Таким способом будували калiброванi кривi окремо для кожного класу iмуноглобулiнiв. Якщо по кожному класу тестується одночасно велика кiлькiсть зразкiв плазми (реально до 960) на одночасно приготовлених пластинах агару, то за умови стандартного часу, що витримується чiтко, iнкубацiї всiх пластин для даного класу iмуноглобулiнiв калiбрована крива залишається незмiнної для усiх видiв пластин.
Для визначення рiвня iмуноглобулiнiв у випробуванiй плазмi на осi абсцис, вiдкладається дiаметр кiльця преципiтацiї даної плазми, вiдновлювали перпендикуляр до пересiкання з калiбровочною кривою, крапку перетинання проектували на осi ординат i вiдраховували вмiст iмуноглобулiнiв вiдповiдного класу.
Визначення вмiсту iмуноглобулiнiв
Пластини, покритi шаром агару з моноспецифiчною антисироваткою, готували для аналiзу всiх 960 зразкiв плазми i зберiгали у холодильнику при + 8°С в герметично закритому полiетиленовому пакетi зi зволоженням. У день доцiльно ставити 480 зразкiв плазми. Прорахунок результатiв проводять з використанням бiнокулярної лупи Результати перераховували на калiброванiй.
Планшети-штативи, у яких знаходяться трубочки з кров'ю, центрифугували 10 хвилин при 400 g. Пiсля цього частину трубочки, що мiстить плазму, вiдрiзали i переносять в iнший аналогiчний планшет-штатив, що упаковується i зберiгається в морозильнiй камерi до визначення вмiсту iмуноглобулiнiв.
2. 3 Постановка бiохiмiчних тестiв
Визначення кiлькостi бiлiрубiна у сироватцi кровi за методом Йендрашика-Клеггорна-Грофа
Принцип методу: дiазотована сульфанiлова кислота взаємодiє з бiлiрубiном сироватки кровi з утворенням комплекса рожево-фiолетового кольору, iнтенсивнiсть фарбування якого пропорцiйна концентрацiї бiлiрубiна та вимiрюється фотометрично. В присутностi акселераторiв (кофеїновий реактив) визначається загальний бiлiрубiн (вiльний та зв’язаний), а при їх вiдсутностi – тiльки прямий (зв’язаний) бiлiрубiн.
Склад набору:
Реагент № 1 Кофеїновий реактив
Кофеїн 52 ммоль/л
Натрiй бензойнокислий 104 ммоль/л
Реагент № 2 Сульфанiлова кислота
Сульфанiлова кислота 29 ммоль/л
Соляна кислота 170 ммоль/л
Дiазореагент. Перед роботою змiшати 10 частин реагента 2 з 0,3 частинами реагента №. 3.
Хiд роботи: Внести в пробiрки сироватку i реагенти за схемою:
Сироватка0,250,250,25
0,9% розчин NaCl0,252,00,5
кофеїновий розчин1,75-1,75
Вмiст пробiрок ретельно перемiшати i залишити при кiмнатнiй температурi для розвитку фарбування. Через 5-10 хв пiсля додавання дiазореагента вимiряти екстiнкцiю дослiдної проби на прямий бiлiрубiн, а через 20 хв – на загальнiй бiлiрубiн. Фотометру вати проти контрольної проби при довжинi хвилi 500-560 нм (зелений свiтлофiльтр) в кюветi з довжиною оптичного шляху 5 мм.
Принцип метода: сироватковi β-глобулiни та лiпопротеїни осаджувалися при рН 7,55 тимоловим реактивом. В залежностi вiд кiлькостi та взаємного вiдношення окремих бiлкових фракцiй при реакцiї виникає помутнiння, iнтенсивнiсть якого вимiрювали турбiдiметрично.
Реактиви:
Концентрований розчин тимола17 мл
Буфер ТРІС 11 ммоль/л; малонова кислота 3,36 ммоль/л; тимол 6,66 ммоль/л.
Калiбровочний розчин 111 мл
Барiй хлористий 48 ммоль/л
Склад реакцiйної сумiши:
Буфер ТРІС, рН 7,55 (25оС)0,160 ммоль/л
Тимол0,098 ммоль/л
Спiввiдношення сироватка/ реакцiйна сумiш 1:61
Приготування розчинiв:
№1У колбу на 1000 мл налити 900 мл дистильованої води i при постiйному перемiшуваннi магнiтною мiшалкою поступово додавали 15 мл реактива 1. розчин доповнюют дистильованою водою до мiтки i перемiшували ще 10 хвилин.
№2У мiрну колбу вмiстом 250 мл пiпеткою помiщували 10 мл реактива 2. доливали охолодженою до +8оС водою до мiтки i перемiшували.
Проведення аналiзу:
Довжина хвилi (620-660 нм), кювета 1 см, температура +15+25оС.
У двох пробiрках змiшували розчин 1 у спiввiдношеннi 60+1 з сироваткою чи фiзрозчином. У наступнiй пробiрцi змiшували фiзрозчин у спiввiдношеннi 60+1 iз сироваткою (контрольнiй розчин 2) – наприклад 3 мл фiзрозчину i 0,05 мл сироватки. Перемiшували i залишали на 30 хв. Потiм знов перемiшували i вимiрювали оптичну щiльнiсть проби А проти контрольного розчину 1
Калiбрували проти контрольного розчину 2.
Калiбровки:
4,51,55
3,03,010
1,54,515
-6,020
Таблиця 1
Методика визначення АЛТ
| Вiдмiряти (мл) |
Проба |
Контрольний розчин |
Реактив 4
Фiзiологiчний розчин
|
0,25 |
0,25
0. 05
|
| Попередньо iнкубували протягом 3 хв. при 37 С. |
| Сироватка кровi |
0. 05 |
1 |
| Інкубували точно 60 хв. при 37 С |
| Реактив 2 |
0. 25 |
0. 25 |
| Перемiшували i залишавали стояти 23 хв. при 15-25 C. |
| Розчин NaOH |
2,50 |
2. 50 |
| Перемiшували и через 10 хвю вимiрювали оптичну щiльнiсть проби проти контрольного розчину (А). |
Принцип методу
Визначення засноване на вимiрi оптичної щiльностi гiдразонiв 2-оксоглутаровой i пiровiноградної кислот у лужному середовищi. Гiдразон пiровiноградної кислоти має бiльш високу оптичну щiльнiсть.
Реактиви
1 Еталонний розчин(3 мл)
натрiй пiровiнограднокислий 2 ммоль/л
2,4-дiнiтрофенiлгiдразин(100 мл)
розчин 1 ммоль/л у HCl 1 моль/л
Натрiй гiдроокис (1 флакон)
Субстрат АЛА(2 х 50 мл)
фосфатний буфер 0. 1. моль/л,
DL-альфа-аланiн 02 моль/л,
2-оксоглутарат 2 ммоль/л
Склад iнкубацiйної сумiшi
Фосфатний буфер рн 7. 4 (25 С) 83,0ммоль/л
01-альфа-аланiн 166. 0ммоль/л
2-оксоглутарат 1,7ммоль/л
Спiввiдношення сироватка кровi/iнкубацiйна сумiш 1/6
Визначення амiнотрансферази ACT у сiроватцi кровi
Таблиця 2
| Вiдмiряти (мл) |
Проба |
|
Реактив 4
Фiзiологiчний розчин
|
0,25 |
0. 25
0. 05
|
| Попередньо iнкубували протягом 3 хв. при 37 С. |
| Сыворотка крови |
0. 05 |
- |
|
|
025 |
025 |
| Перемiшували i залишавали стояти 20 хв. при 15-25 C. |
| Розчин NaOH |
230 |
230 |
| Перемiшували и через 10 хвю вимiрювали оптичну щiльнiсть проби проти контрольного розчину (А). |
Принцип методу
засноване на вимiрi оптичної щiльностi гiдразонiв 2-оксоглутаровой i пiровiноградної кислоти в лужному середовищу. Гiдразон пiровiноградної кислоти, що виникає при мимовiльному декарбоксилюваннi оксалацетата, має бiльш високу оптичну щiльнiсть.
Реактиви
1Еталонний розчин(3 мл)
натрiй пiровiнограднокислий 2 ммоль/л
2,4-динитрофенилгидразин(100 мл)
розчин 1 ммоль/л в АЛЕ 1 моль/л
4Субстрат АСТ(2 х 50 мл)
фосфатний буфер 0,1 моль/л,
Фосфатний буфер рн 7. 4 (25 С)83. 0 ммоль/л
L-аспартат83. 0 ммоль/л
Готування робочого розчину Розчин гiдроокису натрiю
У мiрнiй колбi мiсткiстю 1000 мол розчиняли у дистильованiй водi умiст флакона з Реактивом с. Стiйкiсть: розчин стiйкий
Проведення аналiзу
Довжина хвилi(500-530) нм
Кювету1 см
Температура iнкубацiї(37+- 0. 1) С
Реактив 4 перед аналiзом нагрiвали до (37 ± 0. 1) С
3. Результати та обговорення
Нами проводилося вивчення ефективностi введення в комплексне лiкування гепатиту С iмуномодулюючих препаратiв. Індуктори ІФН, такi як амiксин та циклоферонстимулюють вироблення власних iнтерферонiв, якi не володiють антигеннiстю, їх рiвень не досягає рiвня, здатного проявляти ушкоджуючи дiю на органiзм, тому вони мають менше побiчних ефектiв. Критерiєм пiдбору iмуномодулюючих препаратiв служить чутливiсть i ступiнь зв'язування з iмунними клiтинами.
Проводилося вивчення iмунних показникiв: Т - клiтинного iмунiтету, гуморального iмунiтету, фагоцитарної активностi нейтрофiлiв, цитотоксичної активностi НK i печiнкових проб (АЛТ, АСТ, тимолової проби i бiлiрубiна) у 35 хворих на гепатит С (табл. 3, 4, 5, 6).
Показники клiтинного iмунiтету у хворих на ХГС, %
|
Лейк., *106 |
Лiмф. |
Тлiмф |
Тх |
Тс |
Тк |
Влимф |
Фагоц. активнiсть |
| При застосуваннi амiксину |
5,47 |
28,2 |
63,8 |
52,3 |
11,2 |
47,8 |
12,67 |
51 |
| При застосуваннi циклоферону |
5,07 |
29 |
58,9 |
49,6 |
12,6 |
41,5 |
9,38 |
50,15 |
| До лiкування |
4,2 |
21,4 |
61,2 |
54,5 |
6,7 |
34,6 |
15,63 |
63 |
| Норма |
4,0-8,0 |
19-37 |
55-70 |
40-60 |
10-20 |
30-50 |
6-15 |
40-95 |
фагоцитарна активнiсть – 63%.
Отриманi данi вказують на те, що при застосуваннi амiксину кiлькiсть лейкоцитiв становила 5,47*106 кл/л, з них кiлькiсть лiмфоцитiв складала 28,2% (Т-лiмфоцити 63,8%, з них Тх – 52,3%, Тс – 11,2%, Тк – 47,8%; В-лiмфоцити 12,67%), фагоцитарна активнiсть – 51%. Цi показники кращi, нiж при використаннi циклоферону: лейкоцити 5,07*106 кл/л, з них кiлькiсть лiмфоцитiв складала 29% (Т-лiмфоцити 58,9%, з них Тх – 49,6%, Тс – 12,6%, Тк – 41,5%; В-лiмфоцити 9,38%), фагоцитарна активнiсть – 50,15%.
Данi вказують на те, що прийманнi iмуномоделюючої терапiї наближає показники клiтинного iмунiтету до норми, яка становить: лейкоцити 4-8*106 кл/л, з них кiлькiсть лiмфоцитiв складала 19-37% (Т-лiмфоцити 55-70%, з них Тх – 40-60%, Тс – 10-20%, Тк – 30-50%; В-лiмфоцити 6-15%), фагоцитарна активнiсть – 40-95%.
Таблиця 4
| Варiант |
НК |
|
42,66 |
|
38,54 |
| До лiкування |
22,91 |
| Норма |
50-95 |
Також ми визначали показники цитотоксичної активностi НК-клiтин.
До початку лiкування цитотоксична активнiсть НК-клiтин становила 22,91%. При застосуваннi амiксину, цитотоксична активнiсть НК-клiтин становила 42,66%. При лiкуваннi циклофероном цитотоксична активнiсть НК-клiтин становила 38,54%. Отриманi данi вказують на те, що застосування амiксина, як iмуномоделюючого препарата бiльш наближає цей показник до норми, яка становить 50-95%.
Таблиця 5
Вмiст iмуноглобулiнiв у хворих на ХГС, г/л
| Варiант |
IgA |
IgG |
IgM |
| При застосуваннi амiксину |
2,2 |
14,45 |
1,03 |
| При застосуваннi циклоферону |
2,6 |
14,58 |
0,96 |
| До лiкування |
2,86 |
16,01 |
1,03 |
| Норма |
1,2-2 |
9-18 |
0,9-1,2 |
В наших дослiдах ми також визначали показники гуморального iмунiтету.
При застосуваннi амiксину, як iмуномоделюючого препарату, показники гуморального iмунiтету становили: IgA 2,2 г/л, IgG 14,45 г/л, IgM 1,03 г/л.
При застосуваннi циклоферону показники гуморального iмунiтету становили: IgA 2,6 г/л, IgG 14,58 г/л, IgM 0,96 г/л.
Таблиця 6
Бiохiмiчнi показники у хворих на ХГС
| Варiант |
Бiлiрубiн, мкмоль/л |
АЛТ ммоль/г*л |
АСТ ммоль/г*л |
Тимолова проба мкмоль/л |
| При застосуваннi амiксину |
14,56 |
0,77 |
0,64 |
3,17 |
| При застосуваннi циклоферону |
15 |
2,2 |
0,72 |
4 |
|
19,5 |
0,825 |
1,14 |
2,5 |
| Норма |
8,6-20,5 |
|
0,10-0,68 |
1-4 |
Одним з показникiв, який ми визначали були печiнковi проби – проба на бiлiрубiн, АЛТ (аланiн-амiнотрансфераза), АСТ (аспартат-амiнотрансфераза) i тимолова проба.
До початку лiкування цi показники становили: бiлiрубiн – 14,56 мкмоль/л, АЛТ – 0,77 ммоль/ г*л, АСТ – 0,64 ммоль/ г*л, тимолова проба – 2,5 мкмоль/л.
При лiкуваннi амiксином показники печiнкових проб становили: бiлiрубiн – 19,5 мкмоль/л, АЛТ – 0,825 ммоль/ г*л, АСТ – 1,14 ммоль/ г*л, тимолова проба – 2,5 мкмоль/л.
При лiкуваннi циклофероном цi показники становили: бiлiрубiн – 15 мкмоль/л, АЛТ – 2,2 ммоль/ г*л, АСТ – 0,72 ммоль/ г*л, тимолова проба – 4 мкмоль/л.
З отриманих даних можна побачити, що використання амiксину бiльш наближає показники печiнкових проб до норми, яка складає: бiлiрубiн – 8,6-20,5 мкмоль/л, АЛТ – 0,1-0,68 ммоль/ г*л, АСТ – 0,1-0,68 ммоль/ г*л, тимолова проба – 1-4 мкмоль/л.
При гепатитi С бiлiрубiн та тимолова проба при лiкуваннi та без нього знаходяться у межах норми. Концентрацiя ферментiв АЛТ та АСТ вище норми, що вказує на iнфекцiйний процес у печiнцi. Але при прийомi амiксину нормалiзацiя показникiв АЛТ i АСТ бiльш помiтна.
показникiв Т - клiтинного iмунiтету, гуморального iмунiтету, фагоцитарної активностi нейтрофiлiв. На фонi iмунної корекцiї вiдзначалося полiпшення печiнкових проб крiм рiвня АЛТ (табл. 6), який був набагато вищiм за норму, це вказує на те, що у печiнцi ефективно проходить руйнування клiтин внаслiдок активного iнфекцiйного процесу. Цитотоксична активнiсть НК також залишалася нижче норми – 38,54%, що вказує на те, що iмунна вiдповiдь недостатньо ефективна (табл. 4). При проведеннi 3-х курсiв амiксину в 20 хворих (2 рази на тиждень по 125 мг протягом 5-ти тижнiв - 10 табл. на курс, перерва 1 мiсяць). На фонi нормалiзацiї iнших показникiв цитотоксична активнiсть НК пiсля 3-го курсу наближалася до норми i складала 42,66% (табл. 4), це свiдчить по те, що амiксин бiльш ефективно активує НК-клiтини.
Клiтинна цитотоксичнiсть – дуже важливий механiзм захисту проти вiрусiв, бо викликає елiмiнацiю iнфiкованих вiрусом клiтин та обмеження вiрусної iнфекцiї. При порушеннi цитотоксичностi НК-клiтин у хворих на гепатит С починається хронiзацiя iнфекцiйного процесу, бо в органiзмi продовжується персистенцiя ВГС. Тому на наш погляд показник цитотоксичностi НК-клiтин один з найважливiших при виборi iмуномодулюючого препарату.
Необхiдно вiдзначити, що всi типи ІФН стимулюють НК, прискорюючи їхнє дозрiвання в 150- 300 разiв. ІФН пiдвищують також лiтичний потенцiал кiлерiв (збiльшують вироблення лiтичного фактора на стадiї "летального удару") i таким чином вiдiграють важливу роль у лiзисi клiток-мiшеней (пухлиннi, вiрус-модифiкованi, трансплантацiйнi, функцiонально застарiлi). ІФН необхiднi також для нормального рециклiнга, тобто пiдготовки клiтки до наступного лiтичного циклу, а також для регуляцiї функцiї макрофагiв i нейтрофiлiв, що, у свою чергу, впливають на НК.
В останнi роки оцiнка iмунних реакцiй органiзму на вiрус гепатиту актуальна як для виявлення патогенезу вiрусного гепатиту, так i для прогнозування перебiгу i результату iнфекцiйного процесу, а також контролю проведеної терапiї. Цим пояснюється постiйний iнтерес дослiдникiв до вивчення рiзних етапiв розвитку клiтинної iмунної вiдповiдi, розшифровцi ключових моментiв, що дозволяють манiпулювати iмунною вiдповiддю при данiй патологiї. Нездатнiсть iмунної системи елiмiнувати вiрус базується на зниженнi ефективностi ряду процесiв iмунної вiдповiдi [Подымова, 1994, Семененко, 2000].
Вiрус гепатиту С викликає вираженi змiни функцiональних властивостей не тiльки клiток печiнки, Т- i В-лiмфоцитiв, опосередковуючи реакцiї клiтинного i гуморального iмунiтету, та натуральних кiлерiв (НК). НК - вiдносно рiдка популяцiя клiтин у периферичних лiмфоїдних органах, але є надлишковою у печiнцi, тому часто пiднiмаються питання щодо їхньої функцiї в iмуннiй вiдповiдi на iнфекцiйнi хвороби даного органа. За даними деяких дослiдникiв у формуваннi анергiї (невiдповiдальнiсть органiзму) i не ефективностi противiрусної iмунної вiдповiдi важливу роль грає цитотоксична активнiсть клiтин системи iмунiтету [Титов, 1997].
Клiтинна цитотоксичнiсть - важливий механiзм захисту проти внутрiшньклiтинно локалiзованих збудникiв, особливо, таких як вiруси, що викликають елiмiнацiю вiрус-iнфiкованих клiтин i обмеження вiрусної iнфекцiї при розвитку противiрусної iмунної вiдповiдi. Цитотоксичну активнiсть можуть виявляти кiлька типiв клiток - цитотоксичнi Т-лимфоцити (ЦТЛ), НК клiтини, а iнодi клiтини мiєлоїдного ряду, причому механiзми розпiзнавання мiшенi у них рiзнi. ЦТЛ розпiзнають специфiчнi антигени в асоцiацiї з молекулами гiстосумiсностi (МНС). НК розпiзнають клiтки, у яких знижена чи вiдсутня експресiя молекул МНС класу І [Ройт, 2000]. Бiологiчна активнiсть НК антигеннеспецифiчна i визначає початковi етапи природного неспецифiчного iмунiтету. Дуже важлива роль їх у противiрусному захистi [Фримель, 1987]. Крiм того, НК, як i ЦТЛ, також виявляють антитiлозалежну клiтинну цитотоксичность, чи кiлерну клiтинну цитотоксичность, опосредкованно зв'язуючи специфiчнi антитiла на поверхнi клiтки рецепторами [Семененко, 2000].
Порушення цитотоксической активностi ІКК призводить до неповноцiнної iмунної вiдповiдi i персистенцiї вiрусу в органiзмi, що у свою чергу сприяє хронiзацiї iнфекцiйного процесу при вiрусному гепатитi С, а згодом призводить до розвитку цирозу печiнки i гепатоцелюлярного раку.
НК клiтки здiйснюють двi важливi функцiї в печiнцi: вони стимулюють клiтинну смерть в iнфiкованому органi i супроводжують iндукцiї T клiтинно-опосредкованого iмунiтету шляхом вироблення ИФН-γ [Чекнев, 1993]. Нами припускається, що, якщо активiзувати, природну iмунну вiдповiдь, подiбно адаптивнiй iмуннiй вiдповiдi, то це зробить можливим контролювати реплiкацiю вiрусу протягом ВГС- iнфекцiї. Крiм того, терапевтична активацiя НК - клiток може представляти нову стратегiю в лiкуваннi хронiчного гепатиту, що погодиться з лiтературними даними [Клаус, 1990]
Проведене нами дослiдження при застосуваннi iмуномодулюючих препаратiв – амiксину та циклоферону, показано, що у хворих на хронiчний гепатит С значно нормалiзуються функцiї печiнки по показникам АЛТ, АСТ, тимолової проби та проби на бiлiрубiн. Також вiдбувалася нормалiзацiя клiтинного та гуморального iмунiтету. Бiльш виражений ефект iмуномоделюючої терапiї вiдзначався при застосуваннi амiксину.
Висновки
При застосуваннi iмуномодулюючих препаратiв – амiксину та циклоферону, у 35 хворих на хронiчний гепатит С спостерiгалася нормалiзацiя вмiсту лейкоцитiв, лiмфоцитiв, що свiдчило про позитивну роль цих препаратiв у лiкуваннi.
Недостатня нормалiзацiя показника АЛТ свiдчить про те, що лiкування слiд продовжувати бiльше трьох курсiв.
Список лiтератури
1. Зеваков В. ф., Михайлова А. М., Лаврюкова С. Я. Рiзноманiтнiсть етiологiчних та клiнiчних форм вiрусних гепатитiв. – Одеса: МедЛит 1997. - С. 322-323.
3. Малий В. П., Пеньков Д. Б. Циклоферон у терапiї гострих та хронiчних форм гепатиту С // У зб.: Мат. наук. -практ. конф. i пленуму Асоцiацiї iнфекцiонiстiв України. — Тернопiль, 2001. — С. 235–236.
4. Абдулмеджидова А. Г, Лакина Е. И., Масалова О. В. Изучение структурных и неструктурных белков вируса гепатита С (ВГС) в клетках печени пациентов с хроническим гепатитом С // "Гепатит С (Российский консенсус)". – 2000. - № 6. – С. 65-67.
5. Афанасьев А. Ю.,Зубов С. В., Жданов Ю. Е. ИФА-диагностика в разграничении гепатита С острого и хронического течения // Росс. журн. гастроентер., колопрокт. – 1995. – Т. 5, № 3. - С. 12.
7. Григорьев Н., Яковенко Е. Хронические вирусные гепатиты. // Медицинская газета. – 1995. - № 3, С. 8-9.
8. Григорян С. С, Иванова A. M., Ершов Ф. И. Противовирусная активность "Амиксина" и его влияние на интерфероновый статус при гепатите у мышей. //Вопр. Вирусологии. -1990, №2. -С. 138-140.
9. Григорян С. С, Ершов Ф. И. Клиническая эффективность индукторов интерферона/Современные аспекты применения интерферонов. -1990. -С24.
10. Григорян С. С, Иванова A. M., Ходжаев Ш. Х и др. Интерферон индуцированная активность "Амиксина" и его влияние на интерфероновый статус. //Вопр. Вирусологии. -1990,№1. -С. 61-64.
11. Дидковский Н. А., Коваленко А. Л., Романцов М. Г. Коррекция циклофероном иммунодефицитного состояния / Лечащий врач. — № 5–6, 2000.
12. Ильина Е. Н., Гущин А. Е., Говорун В. М. Новые перспективы генодиагностики в установлении диагноза и мониторинге вирусных гепатитов В и С. // 3-й Всероссийской научно-практической конференция "Генодиагностика в современной медицине": Тез. докл. – М.: Медицина, 2000. С. 216-218.
13. Исаева О. В.,ГущинА. Е., Малишев B. C. Федеральная система внешнего контроля качества выявления HBsAg, анти-ВГС и РНК ВГС: 1996-2001 годи. // IV Российской научно-практической конференции, "Гепатит В,С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики": Тез. докл. – М.: Медицина, 2001. – С. 151-153.
15. Коротяев А. И., Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - СПб.: СпецЛит, 2000. - 591 с.
16. Кузин С. Н., Лисицина Е. В., Самохвалов Е. И Распространение гепатита С и отдельных генотипов вируса гепатита С в регионе с умеренной активностью эпидемического процесса // Вопросы вирусологии. – 1999. - № 2. - С. 79-82.
17. Лакина Е. И., Самохвалов Е. И., Левченко О. Г. Выявление позитивных (геномных) и негативных (репликативных) цепей РНК вируса гепатита С в сыворотке крови, лимфоцитах и ткани печени больных хроническим гепатитом С с помощью полимеразной цепной реакции // Вопр. вирусол. - 2000. - № 4. - С. 37-41.
18. Львов Д. К. Вирусные гепатиты. // Вестник Российской Академии медицинских наук. 1996, №6, - С. 25-31.
19. Львов Д. К., Дерябин П. Г. Географическое Распространение вируса гепатита С и его генотипов. // Вопр. вирусол. – 1997. - № 5. - С. 196-199.
20. Львов Д. К., Миширо С., Селиванов Н. А. Распространение генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территориях Северо-Западной и Центральной частей России.// Вопр. вирусол. – 1995. - № 6. - С. 251-253.
- N2. - С. 14-18.
– 2001. - № 92. - С. 266.
- С. 14-18.
26. Покровский В. И. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. - М.: Медицина, 1993. - С. 104-292.
27. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. – М.: Мир, 2000. – 592с.
28. Романцов М. Г. Применение циклоферона в педиатрической практике. — С. -Пб, 2000. — 64 с.
30. Семененко Т. А. Клеточный иммунный ответ при гепатите С. //Информ. бюллетень. Вирусные гепатиты. - 2000. - №1. - С. 3-9.
31. Солдогуб Т., Мельникова Г., Романцов М., Коваленко А. Эффективность циклоферона при различных формах вирусного гепатита // Врач. — № 11, 1999. — С. 13–15.
32. Титов Л. П. Иммунология и иммунопатология вирусных гепатитов.// Материалы первой международной конференции по вирусным гепатитам. Минск. - 1997. -С. 33-34
35. Циклоферон в педиатрической практике: Метод. рекомендации / Шостакович-Корецкая Л. Р. — Днепропетровск, 2000. — 44 с.
37. Чекнев С. Б. Недостаточность системы интерферона как механизм развития иммунодефицита по естественным киллерам // Иммунология.—1993.—№ 6.—С. 8—12.
39. Adier WH, Nagel JE: Clinical immunology and aging. Principles of Geriatric Medicine and Gerontology // New York, McGraw-Hill. – 1994. - № 5. -P. 61-75.
40. Bukh J., The hepatitis С virus // American Association for the Study of Liver Diseases Post-graduate Course. - 2000 № 6. - P. 102-111.
41. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome // Science. – 1989. - № 244. – Р. 359-62.
42. Dienstag JL, Isselbacher KJ Acute hepatitis // Harrison's Principles of Internal Medicine New York, McGraw-Hill. – 1994. - № 7. - P. 1458-1478.
43. Floreani A, Bertin T, Soffiati G. Are homes for the elderly still a risk area for HBV infection // Eur. J. Epidemiol. – 1992. – №. 8. – Р. 808-811.
45. Hoofnagle JH, Carithers Jr RL, Shapiro C. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. // Hepatology. – 1995. - № 21. – Р. 240-252.
46. Kato N, Ootsuyama Y, Tanaka T. Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of hepatitis С viruses // Vims. Res. – 1992. - № 22. – Р. 107-123.
48. Laverdant С, Algayres JP, Daly J. P. Viral hepatitis in patients over 60 years of age: Clinical, etiologic and developmental aspects // Gastroenterol, Clin. Biol. – 1989. - № 13. – Р. 499-504.
50. Prince A. M, Huima-Byron T., Parker T. S. Visualization of hepatitis С virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins // J. Viral. Hepat. - l996. - № 3. – Р. 11-17.
51. SimorAE, Gordon M, Bishai FR: Prevalence of hepatitis В surface antigen, hepatitis С antibody, and H1V-1 antibody among residents of a long-term-care facility // J. Am. Geriatr. Soc. – 1992. - № 40. – Р. 218-220.
53. Yuasa T, Ishikawa G, Manabe S. The particle size of hepatitis С virus estimated by fil-tration through microporous regenerated cellulose fibre // J. Gen. Virol. – 1991. - № 72. – Р. 2021-2024.
| 
