Реферат/сочинение: "Властивості кальційактивованих та АТФ–індукованих калієвих струмів мембрани міоцитів taenia caeci морської свинки"

Властивостi кальцiйактивованих та АТФ–iндукованих калiєвих струмiв мембрани мiоцитiв taenia caeci морської свинки

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

НЕСІН ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ

УДК 577. 352:612. 73

ВЛАСТИВОСТІ КАЛЬЦІЙАКТИВОВАНИХ ТА

АТФ – ІНДУКОВАНИХ КАЛІЄВИХ СТРУМІВ МЕМБРАНИ МІОЦИТІВ Т AENIA CAECI МОРСЬКОЇ СВИНКИ

03. 00. 02 - бiофiзика

на здобуття наукового ступеня

кандидата бiологiчних наук

КИЇВ – 2008

Дисертацiєю є рукопис

Роботу виконано у вiддiлi нервово-м’язової фiзiологiї Інституту фiзiологiї iм. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керiвник: академiк НАН України, доктор медичних наукпрофесорШуба Михайло Федорович

доктор медичних наук, професор головний науковий спiвробiтник Інституту фармакологiї та токсикологiї АМН України;

доктор бiологiчних наук, професор Мiрошниченко Микола Степанович зав. кафедри бiофiзики, бiологiчного факультету Київського нацiонального унiверситету iм. Тараса Шевченка

Захист вiдбудеться “5” лютого 2008 р. о 14⁰⁰ годинi на засiданнi спецiалiзованої вченої ради Д-26. 198. 01 при Інститутi фiзiологiї iм. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Вчений секретар Спецiалiзованої вченої ради, доктор бiологiчних наук З. О. Сорокiна-Марiна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть теми. Основнi функцiї кишечнику тiсно пов’язанi з його моторикою (сегментарне скорочення та перистальтичнi хвилi), i забезпечується узгодженою роботою гладеньких м’язiв поздовжнього та кiльцевого шару стiнки кишки. Моторна функцiя кишечнику надзвичайно важлива для процесiв травлення та всмоктування поживних речовин. Вона забезпечує пiдвищення внутрiшньокишкового тиску, що сприяє фiльтрацiї розчинiв з порожнини кишечнику до кровi i лiмфи та перемiщення залишкiв хiмуса за рахунок перистальтики по кишечнику. При багатьох патологiчних процесах в травнiй системi вiдбувається порушення транзиту вмiсту кишечнику. Цi порушення виступають головними причинами виникнення таких ускладнень, як пiсляоперацiйнi парези, метеоризм, абдомiнальний бiль та запори. Тому гладенькi м’язи кишечнику є одним iз важливих об’єктiв дослiдження фундаментальної та прикладної науки.

м’язiв. Одним з медiаторiв гальмування iнтестинальних гладеньких м’язiв є аденозин-5’-трифосфат (АТФ), який викликає гiперполяризацiю мембрани гладеньком’язових клiтин (ГМК), пригнiчення спонтанної активностi i, як наслiдок, розслаблення м’язiв (Burnstock et al. 1963). Вперше пуринергiчне гальмування вдалося заблокувати апамiном (токсин з отрути бджоли) у вiддiлi Шуби М. Ф. (Владимирова, Шуба 1978). Пiзнiше в лабораторiї Барнстока було показано, що апамiн блокує калiєву провiднiсть мембрани (Banks et al. 1978). Вважається, що пуринергiчне гальмування опосередковане активацiєю метаботропних пуринорецепторiв (P2Y) i центральною ланкою цього гальмування є пiдвищення рiвня внутрiшньоклiтинного кальцiю за рахунок вивiльнення його з внутрiшньоклiтинного iнозитолтрифосфатного (IP₃ ) кальцiєвого депо та наступною активацiєю кальцiйзалежних калiєвих каналiв малої провiдностi (SK) (Sanders et al. 1996).

Питання про типи кальцiйзалежних калiєвих каналiв (К_Са ) в мембранi цих клiтин та можливої їх участi у пуринергiчному гальмуваннi залишається вiдкритим. Тому значний науковий iнтерес викликає видiлення компонентiв кальцiйзалежного калiєвого струму (І_К(Ca) ) iз сумарного трансмембранного iонного струму, дослiдження їх фармако–бiофiзичних характеристик, а також визначення їх внеску у процеси пуринергiчного гальмування гладеньких м’язiв шлунково–кишкового тракту (ШКТ).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукових програм вiддiлу нервово-м’язової фiзiологiї Інституту фiзiологiї iм. О. О. Богомольця НАН України: “Механiзми метаболiчної регуляцiї iонних каналiв та скорочення гладеньком’язових клiтин”(№ держ. реєстрацiї 0198U001935), “Мембраннi та внутрiшньоклiтиннi механiзми регуляцiї скорочення i активностi iонних каналiв гладеньком’язових клiтин нейромедiаторами”(№ держ. реєстрацiї 0101U002636) та “Мембраннi та метаболiчнi механiзми збуджувальної та гальмiвної дiї нейромедiаторiв на гладенькi м’язи”(№ держ. реєстрацiї 0105U003235).

Мета та завдання дослiдження. Метою даної роботи було видiлення компонентiв сумарного кальцiйзалежного калiєвого струму i визначення їх внеску в пуринергiчне гальмування кишечнику. Для досягнення цiєї мети були поставленi наступнi завдання:

2. Дослiдити властивостi кальцiйзалежного калiєвого струму мембрани гладеньком’язових клiтин taenia caeci морської свинки, роздiливши його на компоненти за допомогою паксилiну, ТЕА та d-тубокурарину,

4. Визначити компоненти кальцiйзалежного калiєвого струму мембрани мiоцитiв при активацiї пуринорецепторiв.

Наукова новизна роботи. За допомогою методу фiксацiї потенцiалу в конфiгурацiї “whole-cell patch-clamp” було проведено роздiлення на компоненти iнтегральних калiєвих струмiв та вивчення їх бiофiзичних та фармакологiчних характеристик. Вперше виявлено блокуючу дiю вiдомого нейротоксина d-тубокурарину на трансмембраннi iоннi струми та кальцiйзалежнi калiєвi струми поодиноких свiжоiзольованих ГМК кишечнику. Показано, що вихiднi iнтегральнi трансмембраннi iоннi струми мають три складовi: потенцiалзалежний струм «затриманого випрямлення» та два компоненти І_К(Ca) : І_К(Ca) , що переноситься через SK канали та блокується d-тубокурарином i І_К(Ca) , що переноситься через К_Са канали великої провiдностi (BK) чутливi до дiї паксилiну та ТЕА. Показано, що спонтаннi вихiднi струми (СВС) за своїми ознаками та чутливiстю до блокаторiв можна роздiлити на струми малої та великої амплiтуди. СВС малої амплiтуди чутливi до блокуючої дiї d-тубокурарину i обумовленi активацiєю SК каналiв, а СВС великої амплiтуди блокуються паксилiном i ТЕА та формуються за рахунок активацiї BК каналiв.

Дослiдження клiтинних механiзмiв пуринергiчного гальмування показало, що основна роль належить активацiї кальцiйзалежних калiєвих каналiв малої провiдностi, внаслiдок вивiльнення Са²⁺ iз iнозитолтрифосфатчутливого кальцiєвого депо саркоплазматичного ретикулуму.

Теоретичне та практичне значення роботи. Представлена робота має як фундаментальне так i практичне значення, оскiльки значно поглиблює та розширює сучаснi уявлення про клiтиннi механiзми гальмування в гладеньких м’язах. В роботi проведено роздiлення вихiдного трансмембранного iонного струму на потенцiалзалежний та кальцiйзалежний компоненти, дослiджено фармако−бiофiзичнi характеристики кальцiйзалежних калiєвих струмiв. Виявлено клiтиннi механiзми регуляцiї кальцiйзалежних калiєвих каналiв, при активацiї метаботропних пуринорецепторiв. Результати дослiджень можуть бути використанi бiофiзиками, фiзiологами та фармакологами для створення нових засобiв корекцiї розладiв ШКТ.

Особистий внесок. Всi електрофiзiологiчнi дослiдження вихiдного iнтегрального трансмембранного iонного струму та його компонент, спонтанних вихiдних струмiв, описаних в роботi, а також отримання функцiонально повноцiнних поодиноких ГМК, обробка експериментального матерiалу були виконанi особисто автором. Аналiз та узагальнення результатiв дослiджень були обговоренi з науковим керiвником та спiвавторами публiкацiй.

Апробацiя роботи. Основнi положення роботи доповiдались на семiнарах вiддiлу нервово−м’язової фiзiологiї та поточних наукових семiнарах Інституту фiзiологiї iм. О. О. Богомольця НАН України (2002-2007), на мiжнароднiй спецiалiзованiй школi нейронаук IBRO “Рецептори, канали, месенджери” (Ялта, 2004), Мiжнароднiй науковiй конференцiї “Клiтиннi i субклiтиннi механiзми функцiонування травної системи” (Львiв, 2004), І Українськiй науковiй конференцiї “Проблеми бiологiчної i медичної фiзики ” (Харкiв, 2004), Мiжнароднiй науковiй конференцiї “Механiзми функцiонування фiзiологiчних систем”, (Львiв, 2006), 4 з’їздi Українського бiофiзичного товариства (Донецьк, 2006).

Публiкацiї. Матерiали дисертацiї опублiкованi в п’яти наукових статтях i п’яти тезах доповiдей в матерiалах наукових зiбрань.

Структура та обсяг дисертацiї. на 111 сторiнках (без списку лiтератури), iлюстрована 39 рисунками та 2 таблицями.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослiдження було проведено на свiжоiзольованих поодиноких ГМК поздовжнього м’язового шару слiпої кишки (taenia cаесi) морської свинки. Для видiлення клiтин шматочки taenia cаесi помiщали до 2 мл номiнально безкальцiєвого розчину, що мiстив 3 мг колагенази (тип IА), 2 мг бичачого сироваткового альбумiну, 2 мг соєвого iнгiбiтору трипсину та 2 мг таурину (поглинач вiльних радикалiв) на 25 - 35 хв. при 34 ^о С. Обробленi таким чином шматочки taenia cаесi вiдмивалися вiд ферменту i багаторазово пропускалися через пастерiвську пiпетку в номiнально безкальцiєвому розчинi.

В основнiй частинi експериментiв для дослiдження iонних струмiв iзольованих ГМК застосовувалась “whole-cell” конфiгурацiя методу “patch-clamp” (Hamill et al. 1981). Мiкропiпетки виготовляли з м’якого молiбденового скла, пiсля заповнення розчином вони мали опiр 2 - 4 МОм. Зовнiшнiй розчин мав наступний склад (мМ): NaCl 120. 4; КCl 5. 9; CaCl₂ 2. 5; MgCl₂ 1. 2; d-глюкоза 11,5; HEPES 5; pH 7. 4 (NaOH). Пiпетковий розчин мав такий склад (мМ): КCl 135; MgSO₄₂ ATФ 2; ЕГТА 0. 3; HEPES 10; pH 7. 3 (КOH). Внутрiшньоклiтинна концентрацiя вiльного Са²⁺ ([Ca²⁺ ]_i ) при використаннi останнього розчину була близькою до фiзiологiчної i становила приблизно 100 нМ. При дослiдженнi Са²⁺_Ca ) iони К⁺⁺ , також до зовнiшнього розчину додавали 5 мМ тетраетиламонiю (ТЕА). Експерименти проводились при кiмнатнiй температурi (22-24 ^o C).

Реєстрацiя iонних струмiв проводилась за допомогою пiдсилювача “L/M ЕРС-5”. Сигнал з виходу перетворювача струм - напруга надходив через фiльтр низьких частот (частота зрiзу 1 кГц) на аналого-цифровий перетворювач i далi в комп’ютер ІВМ РС/АТ. Данi аналiзувались за допомогою програм “pCLAMP 5. 5” та “Origin 5. 0”.

Значення величин вказанi як: середнє арифметичне ± стандартна похибка середнього арифметичного. В скобках вказано кiлькiсть клiтин. Данi порiвнювали за допомогою парного двохстороннього t-тест Стьюдента. Вiдмiнностi вважали статистично достовiрними при значеннi Р<0. 05.

Результати дослiджень. ²⁺ залежних К⁺_К(Са)⁺ за допомогою ступiнчастих змiщень мембранного потенцiалу вiд пiдтримуваного рiвня – 60 мВ, що наближується до фiзiологiчного потенцiалу спокою цих клiтин. Типовi значення вхiдного опору клiтин, що використовувались в наших експериментах, складали 1 - 2 ГОм. В дослiджуваних клiтинах при ступiнчатих деполяризуючих змiщеннях мембранного потенцiалу вiд пiдтримуваного потенцiалу –60 мВ тривалiстю 250 мс, виникав вихiдний струм з порогом активацiї –30 мВ. Аплiкацiя паксилiну за таких експериментальних умов викликала значне пригнiчення вихiдного струму, також знижувались його осциляцiї. На рис. 1 показана дiя паксилiну (100 нМ) на трансмембранний iонний струм. На цьому ж рисунку подана динамiка дiї паксилiну на амплiтуду вихiдного струму. Ефект паксилiну досягав максимуму протягом 2 – 3 хвилин вiд початку його аплiкацiї. Постiйна часу дiї паксилiну складала 1,3 ± 0,3 хв (n=5). Вiдновлення амплiтуди вихiдного струму при вiдмиваннi токсину вiдбувалось з постiйною часу 0,9 ± 0,1 хв (n=5).

_К(Са) , що переноситься через ВК канали, отриманого шляхом вiднiманням значень струму при дiї блокатора вiд контрольних значень.

На ВАХ паксилiнчутливого І_К(Са) (рис. 2. А) спостерiгається змiна крутизни “перегин” в районi максимуму активацiї І_Са²⁺ в серединi клiтини. Крiм того, канали, через якi переноситься паксилiнчутливий І_К(Са) , проявляли потенцiалзалежнi властивостi. Зi збiльшенням рiвня деполяризацiї спостерiгалось збiльшення його амплiтуди, незважаючи на зменшення входу Са²⁺ в клiтини при потенцiалах +20…+40 мВ. На рисунку 2. Б показано кривi нормалiзованої провiдностi вихiдного струму. Половина максимальної активацiї V_0,5 в контролi складала 32. 6±1. 2 мВ, а коефiцiєнт крутизни становив 12±0. 7 мВ. При дiї паксилiну цi значення становили 19. 1± 0. 9 мВ та 15± 0. 6 мВ вiдповiдно (n=7).

ТЕА − вiдомий неселективний блокатор калiєвих каналiв (Blatz et al. 1984, Benham et al. 1985). В концентрацiї 1 мМ ТЕА блокував вихiдний струм, викликаний змiщенням мембранного потенцiалу вiд пiдтримуваного рiвня –60 мВ до +50 мВ, бiльш нiж на 50±6 % (n=6). Паксилiн, при додаваннi його в концентрацiї 100 нМ до розчину ТЕА (1 мМ), не викликав додаткового зменшення вихiдного струму (рис. 3. А). В той же час, додаткова аплiкацiя ТЕА (1мМ) (рис. 3. Б) в присутностi паксилiну, призводить до подальшого пригнiчення вихiдного струму.

_K(Ca) , який переносяться через К_Са великої провiдностi ефективно та однаково блокується наномолярними концентрацiями харибдотоксину та ТЕА в концентрацiї 1 мМ. В той же час паксилiн, високоспецiфiчний блокатор К_Са каналiв великої провiдностi призводить до меншого блокування, нiж ТЕА, i, вiдповiдно, харибдотоксин.

В якостi блокатора SК каналiв було застосовано d-ТК, що є вiдомим модулятором нiкотинових холiнорецепторiв (Wenningmann et al. 2001) та широко застосовується як в дослiдницьких цiлях, так i в медицинi. Але вiдомi iншi данi про його додатковi властивостi, як блокатора К_Са каналiв (Vacher et al. 1998, Ishii et al. 1997). В зв’язку з тим, що на ГМК кишечнику не встановлено наявнiсть нiкотинових холiнорецепторiв, це дало пiдстави використати та вивчити вплив d-ТК на iоннi струми, що протiкають через мембрану мiоцитiв. Аплiкацiя d-ТК (500нМ–1мМ) пригнiчувала вихiдний трансмембранний струм, викликаний ступiнчастим змiщенням мембранного потенцiалу вiд пiдтримуваного рiвня − 60 мВ, у концентрацiйно–залежний спосiб. З побудованої кривої доза-ефект, було встановлено, що концентрацiя половинного ефекту становить ІС₅₀ = 38±5 мкМ (n=7).

На рисунку 4. подано динамiку дiї d-ТК на амплiтуду вихiдного струму з часом. Часова розгортка дiї d-ТК (50 мкМ) показала, що повний ефект блокування досягав максимуму через 2,5 - 3,5 хвилини пiсля початку прикладання блокатора. Постiйна часу дiї d-ТК складала 1 ± 0,2 хв (n=5). Вiдновлення амплiтуди вихiдного струму при вiдмиваннi токсину 1,2 ± 0,2 хв (n=5).

Усередненi (n=9) ВАХ дiї d-ТК на трансмембранний iонний струм наведено на рис 5. Як видно з рисунка, вклад d-TK чутливого струму в загальний вихiдний струм на максимумi та в кiнцi деполяризуючого iмпульсу, тривалiстю 500 мс, був приблизно однаковим. Виходячи з динамiки кривої ВАХ можна зробити висновок, що канали, через якi переноситься d-TKчутливий струм, не проявляють потенцiалзалежних властивостей. Поряд з цим на ВАХ досить добре простежується максимум в районi +40 мВ, що не спiвпадає з максимумом I_Ca авторiв, пов’язано з кальцiйзалежними механiзмами вивiльнення кальцiю з внутрiшньоклiтинного кальцiєвого депо.

В наступних дослiдах для роздiлення вихiдного струму на компоненти та вивчення його характеристик було використано селективний блокатор BK каналiв - паксилiн (100нМ) (Gungdi et al. 1999). Додавання до зовнiшнього розчину паксилiну викликало значне пригнiчення вихiдного струму (рис 6. А), та суттєво зменшувались осциляцiї. Додаткове додавання d-TK на фонi паксилiну викликало додатково незначне пригнiчення вихiдного струму. На рис 6. Б наведено дiю d-ТК на вихiдний струм. Як i в попередньому разi, d-ТК заблокував незначну частину вихiдного струму, до того ж осциляцiї струму та його кiнетика майже не змiнилась. Додавання паксилiну до розчину в присутностi d-ТК, призводило до значного пригнiчення вихiдного струму, при цьому значно зменшувались осциляцiї струму та його кiнетика. Отриманнi данi дозволяють зробити припущення, що паксилiн та d-ТК дiють на рiзнi типи каналiв незалежно один вiд одного. До того ж слiд вiдмiтити, що вклад паксилiнчутливих каналiв до загального вихiдного струму значно бiльший, нiж вклад d-тубокураринчутливих каналiв.

Властивостi спонтанних вихiдних струмiв гладеньком’язових клiтин. Друга частина роботи була присвячена вивченню характеристик спонтанних вихiдних струмiв (СВС), та впливу на них блокаторiв калiєвих каналiв. В багатьох клiтинах при деполяризуючих змiщеннях мембранного потенцiалу виникали СВС, реєстрацiя яких проводилась протягом 100 с. СВС починали з’являтись при потенцiалах бiльш позитивних нiж − 60 мВ (рис. 7). Як видно з рисунка, зi збiльшенням мембранного потенцiалу зростали амплiтуда та частота зареєстрованих СВС.

СВС рiзної амплiтуди можуть утворюватись за рахунок багаторазового локального звiльнення Са²⁺ з внутрiшньоклiтинного депо, а також неоднорiдностi популяцiї кальцiйактивованих калiєвих каналiв. Як встановлено, в утвореннi СВС приймають участь як ВК канали, так i SК канали. Окрiм цього, в деяких роботах (Kong et al. 2000) припускають, що СВС малої амплiтуди в бiльшостi формуються за рахунок активацiї SК, в той час як СВС великої амплiтуди − за рахунок активацiї ВК.

Дiя блокаторiв К_Са каналiв, d-ТК та ТЕА, на СВС (пiдтримуваний потенцiал – 30 мВ) наведено на рис. 8. Аплiкацiя d-ТК, як блокатора SК каналiв, призводила до пригнiчення СВС малої амплiтуди, в той час як частота появи СВС великої амплiтуди майже не зменшувалась. Додавання ТЕА (1мМ) як блокатора ВК каналiв, на фонi дiї d-ТК призводило до пригнiчення не тiльки СВС великої амплiтуди, але i залишкових СВС малої амплiтуди. На рисунку 8. Б подано амплiтудну гiстограму блокуючої дiї d-ТК та ТЕА на СВС мембрани ГМК. Ймовiрно, що СВС великої амплiтуди мають в своєму складi d-ТК чутливий компонент, що переноситься через SК канали. В той же час в формуваннi СВС малої амплiтуди приймає участь ТЕАчутливий компонент.

В ластивостi спонтанних вихiдних струмiв, викликаних пуринергiчною активацiєю ГМК кишечнику морської свинки. Активацiя пуринорецепторiв мембрани iнтестинальних ГМК аплiкацiєю АТФ, доданого до зовнiшнього розчину, активує К_Ca канали. Ми вивчали ефекти наведеного агонiста на струм при пiдтримуваному потенцiалi − 40 мВ.

За таких умов АТФ в концентрацiї 100 мкM iстотно пiдвищував частоту появи СВС, а особливо компоненти малої амплiтуди. Прирiст СВС малої амплiтуди на максимумi складав 60% ±5% (n=4) (рис. 9).

У бiльшостi ГМК локальне спонтанне вивiльнення кальцiю (спарки) обумовлено активнiстю рiанодинових депо, оскiльки аплiкацiя рiанодину викликає блокування спонтанного та пiдсиленого агонiстами вивiльнення iонiв Са²⁺ (Guerrero-Hernandez et al. 2002). З iншого боку показано, що видiлення кальцiю з iнозитолтрифосфат (ІР₃²⁺₃₃ та наступне видiлення Са²⁺ нейротрансмiттером, видiленим з ентеро-мотонейронiв (Shuba et al. 2003).

Преiнкубацiя клiтин в розчинi, що мiстив 30 мкМ 2-АРВ, блокатора ІР₃ рецепторiв, протягом 10 хвилин показала, що прикладення АТФ (100 мкМ) не призводить до суттєвих змiн у частотi появи викликаних СВС, як малої так i великої амплiтуди (рис. 10). Окрiм цього, iнкубацiя в розчинi 2-АРВ призводить до незначного зменшення частоти СВС малої амплiтуди (данi не наведено), що може свiдчити про залежнiсть цiєї частини СВС вiд кальцiю, що звiльняється з ІР₃₃

Для блокування ІР₃ шляху застосовували блокатор фосфолiпази С (U73122). За таких умов не вiдбувалось збiльшення частоти СВС при аплiкацiї АТФ. (Рис. 11). Вiдсутнiсть збiльшення частоти СВС у вiдповiдь на аплiкацiю АТФ на фонi U73122 до зовнiшнього розчину свiдчить, що ІР₃ залежне збiльшення вивiльнення кальцiю − основний механiзм P2Y рецептор-модульованої стимуляцiї вихiдного струму та гiперполяризацiї. Вивiльнення кальцiю асоцiйоване з активацiєю SK та BK каналiв мiоцитiв taenia caeci.

На рис. 12 подано вплив блокаторiв К_Са каналiв на викликанi агонiстiндукованою активацiєю СВС. Потенцiал фiксацiї становив – 40 мВ. Як видно d-ТК, як антагонiст SK каналiв, в концентрацiї 50 мкМ послаблював СВС малої амплiтуди (Рис. 12). СВС записано протягом 100 сек. реєстрацiї (n= 5). СВС великої амплiтуди були також дещо пригнiченi застосуванням d-ТК. Це вказує на наявнiсть в складi викликаних СВС великої амплiтуди компоненти струму d-ТКчутливих каналiв. Результати свiдчать, що СВС у ГМК taenia caeci морської свинки, є результатом вiдкривань BK каналiв та d-ТКчутливих каналiв. Аплiкацiя ТЕА (1 мМ), як неселективного блокатора ВК каналiв, на фонi дiї d-ТК блокувала не лише СВС великої амплiтуди, але i залишковi СВС малої амплiтуди. На рис. 12 Б. наведено амплiтудну гiстограму блокуючої дiї d-ТК та ТЕА на СВС, iндукованi аплiкацiєю АТФ. Пригнiчення SK каналiв може призводити до редукцiї СВС великої амплiтуди та сприйняття останнiх в якостi СВС малої амплiтуди пiсля застосування d-ТК.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

В результатi проведених дослiджень по роздiленню сумарного трансмембранного iонного струму ГМК поздовжнього м’яза слiпої кишки (taenia саесi) морської свинки на компоненти, дослiдженню їх фармако-бiофiзичних характеристик було показано, що при ступiнчастiй деполяризацiї мембрани в переносi вихiдного струму приймають участь потенцiалкерованi К⁺ канали затриманого випрямлення та два типи К_Са каналiв, що узгоджується з лiтературними даними (Жолос та iн. 1986, Yamamoto et al 1989). Показано наявнiсть паксилiнчутливого I_K(Ca) , що переноситься через ВК, та паксилiннечутливого компоненту. Ранiше було показано (Повстян та iн. 2000), що I_K(Ca) , якi переносяться через К_Са великої провiдностi, ефективно блокуються наномолярними концентрацiями харибдотоксину та ТЕА в концентрацiї 1 мМ. В той же час паксилiн, високоспецiфiчний блокатор К_Са каналiв великої провiдностi не призводив до блокування вихiдних струмiв, як це було показано для харибдотоксина та ТЕА. На фонi дiї паксилiну (100 нМ) ТЕА в концентрацiї 1 мМ проявляв подальше пригнiчення вихiдних К⁺ вольт-амперна характеристика має перегин в областi максимуму кальцiєвого струму, що може свiдчити про залежнiсть цього струму вiд внутрiшньоклiтинної концентрацiї кальцiю. Це вказує на наявнiсть паксилiннечутливого компоненту К⁺ струмiв, який блокується менш селективними блокаторами, такими як ТЕА та харибдотоксин, останнiй має блокуючий вплив, як на ВК канали (Knaus et al. 1994, Orio et al. 2002), так i на К_Са промiжної провiдностi (ІК) (Bychkov et al. 2002, Edwards et al. 1998; 2000). З’ясування природи цього компоненту К⁺ струму вимагає застосування бiльш селективних блокаторiв К⁺ каналiв.

Другий вагомий компонент К_Са струму переноситься через К_Са канали малої провiдностi, для яких селективним блокатором виступає апамiн (Shuba et al. 1981, Shuba et al. 2000, Burnham et al. 2002). Але, як було показано (Повстян та iн. 2000), апамiн має побiчну дiю у виглядi активацiї каналiв, що переносять неселективний катiонний струм. Для усунення невизначеностi дiї апамiну, в наших дослiдах в якостi блокатора SК каналiв було застосовано d-TK, що є вiдомим модулятором нiкотинових холiнорецепторiв та широко застосовується, як в дослiдницьких цiлях, так i в медицинi (Wenningmann et al. 2001). Але окрiм впливу на нiкотиновi холiнорецептори iснують данi про його додатковi властивостi, як блокатора К_Са струми, що протiкають через мембрану ГМК taenia cеасi морської свинки.

Ефект блокування I_K(Ca) аплiкацiєю d-ТК досягав максимума через 2,5 - 3,5 хвилини пiсля початку прикладення блокатора. I_K(Ca) , що переноситься через SК канали, не проявляв на вiдмiну вiд паксилiнчутливого струму, часозалежної iнактивацiї та потенцiалзалежних властивостей. Крива ВАХ цього струму мала максимум в дiапазонi + 30, + 50 мВ, що не спiвпадає з максимумом кальцiєвого струму котрий знаходиться в дiапазонi потенцiалiв бiля +10 мВ. Подiбнi ефекти було описано на вiсцеральних гладеньком’язових клiтинах (Yamamoto et al. 1989, Zholos et al. 1992), та були пов’язанi з кальцiйзалежними механiзмами вивiльнення кальцiю з внутрiшньоклiтинного кальцiєвого депо. Поряд з цим дослiдження, проведенi по вивченню впливу d-ТК на вхiднi Са²⁺²⁺ канали L – типу, котрi були виявленi на мембранi ГМК (Yamamoto et al. 1989, Жолос та iн. 1986, Зима та iн. 1994), що збiгається з лiтературними даними (Wang et al. 1999).

Окрiм наведених вiдмiнностей встановлено, що ВК та SK канали сильно вiдрiзняються по чутливостi до ТЕА, неселективного блокатора К⁺ каналiв. Як було сказано вище, ВК канали блокуються при додаваннi до зовнiшнього розчину ТЕА в низьких концентрацiях, що в наших дослiдах складало 1 мМ. В той же час SK канали, що з успiхом блокувались низькими концентрацiями d-ТК (50 мкМ), виявились нечутливими до аплiкацiї ТЕА навiть в концентрацiях 4 – 5 мМ, що узгоджується з лiтературними даними (Latorre et al. 1983, Blatz et al. 1984, Benham et al. 1985). Бiльше того, було показано (Blatz et al. 1986), що ТЕА не виявляє блокуючої дiї на SK канали навiть в великих концентрацiях (20– 25 мМ).

Одною з найважливiших характеристик I_K(Ca) , що переноситься як через ВК канали так i SK канали, є чутливiсть цих каналiв до змiни [Са²⁺ ]_i . З лiтературних джерел вiдомо (Becker et al. 1989, Ganitkevich et al. 1991), що при фiзiологiчних умовах [Са²⁺ ]_i в ГМК знаходиться в дiапазонi 100 – 120 нМ. При деполяризуючих змiщеннях мембранного потенцiалу до 0 мВ [Са²⁺ ]_i рiзко зростає, досягаючи рiвня 1000 нМ, пiсля чого спадає до стацiонарного рiвня 200 – 300 нМ, на якому продовжує триматися протягом декiлькох секунд до припинення деполяризацiї. Аналогiчнi данi були отриманнi в дослiдах на тонкому кишечнику мишей (Vogalis et al. 1997). В цiй роботi було визначено порогову [Са²⁺ ]_i⁺ каналiв, що становила 85 нМ. В той же час для активацiї ВК каналiв необхiдна значно вища [Са²⁺ ]_i , нiж для SК каналiв. Проведенi дослiди з використанням iонiв Со²⁺²⁺ ]_i за рахунок надходження iонiв Са²⁺ ззовнi клiтини, та/або вивiльнення їх з внутрiшньоклiтинного депо.

Вiдносний вклад кожного з компонентiв в сумарний вихiдний струм варiював у рiзних клiтин, але в бiльшостi випадкiв величина їх залишалась в певних межах. Було встановлено, що близько 90% вихiдного трансмембранного струму переноситься через потенцiалкерованi К⁺ канали “затриманого випрямлення” та ТЕАчутливi ВК канали. В свою чергу, бiльш детальний вклад кожного компоненту до загального струму варiював наступних межах: 30 – 45% для Са²⁺ незалежного К⁺ струму “затриманого випрямлення”, 40 – 50% для паксилiнчутливого I_K(Ca)_K та 5 – 15% для d-ТКчутливого I_K(Ca) , що переноситься через SК канали. Потрiбно наголосити, що результати про процентний вклад кожного з вищеназваних компонент до загального вихiдного струму, отриманi за допомогою фармакологiчного роздiлення, спiвпадали з результатами отриманими за допомогою вiднiмання окремих компонент вихiдного струму.

Отриманнi нами данi свiдчать, що в ГМК taenia cаесi морської свинки окрiм викликаних вихiдних калiєвих струмiв можуть також виникати СВС. На сьогоднiшнiй день аналогiчнi струми вже описанi в багатьох ГМК: трахеї, рiзних вiддiлах кишечнику та кровоносних судин (Шуба 1965, Bolton et al. 1996). Фiзiологiчна роль СВС, поки що достеменно невiдома.

Велике зацiкавлення викликає питання з приводу джерела Са²⁺ , необхiдного для активацiї кожного зi згаданих ранiше компонентiв I_K(Ca) . На сьогоднi iснує багато думок з цього приводу. Проведенi нами дослiди, а також отриманнi ранiше данi (Cole et al. 1989, Повстян та iн. 1997) наочно демонстрували, що амплiтуда вихiдного К⁺ струму, через наявнiсть Са²⁺²⁺²⁺ канали пiд час деполяризуючого змiщення мембранного потенцiалу. Блокування цих каналiв iонами Со²⁺ призводило до значного пригнiчення вихiдного струму. Нездатнiсть паксилiна пригнiчувати вихiдний струм в умовах блокування входу iонiв Са²⁺_Са каналiв великої провiдностi ГМК taenia caeci морської свинки необхiдне значне пiдвищення [Са²⁺ ]_i в даному разi за рахунок входу iонiв Са²⁺ ззовнi через потенцiалкерованi Са²⁺ канали L-типу. В той самий час, для активацiї SК потрiбно незначне пiдвищення [Са²⁺ ]_i вище порогового рiвня, як зазначалось ранiше, близько 85 нМ (Vogalis, Goyal 1997).

²⁺ , якi спонтанно вивiльняються з саркоплазматичного ретикулуму (СР), так званi Са²⁺ спарки, також можуть викликати активацiю К_Са , при цьому активнiсть каналiв буде проявлятись у виглядi СВС (Bolton et al. 1996, Gordienko et al. 1998, Bayguinov et al 2001). Са²⁺ спарки призводять до локального пiдвищення [Са²⁺ ]_i , що в свою чергу призводить до активацiї невеликої кiлькостi К_Са (10-100) (Бурый та iн. 1992, Benham et al. 1986), якi генерують появу СВС. Лише суттєве вивiльнення Са²⁺ з СР (викликане наприклад аплiкацiєю кофеїну) може призвести до активацiї великої кiлькостi К_Са²⁺ депо видається мало ймовiрним.

В однiй з недавнiх робiт, що стосувалась вивчення впливу апамiна на iоннi струми iзольованих ГМК ШКТ (Kong et al. 2000) було показано, що СВС можна роздiлити на два типи – великої та малої амплiтуди. Першi блокувались харибдотоксином та утворювались завдяки активацiї ВК каналiв, а другi − апамiном, i, вiдповiдно формувались SК каналами. Проведенi нами дослiди показали, що паксилiн ефективно блокував СВС великої амплiтуди, при цьому частота СВС малої амплiтуди майже не змiнювалась, i, вiдповiдно, не блокувались паксилiном. що узгоджується з наведеними даними. В той же час d –TK призводив до блокування СВС малої амплiтуди, що може свiдчити про те, що вони формуються за рахунок активацiї SК. ТЕА неселективний блокатор К⁺ каналiв, на вiдмiну вiд паксилiна, блокуючи СВС великої провiдностi також незначно пригнiчував СВС малої амплiтуди. Як було показано, на iнтегральних струмах iснує К⁺ провiднiсть, яка нечутлива до паксилiну, але блокується ТЕА, i вiдповiдно робить вклад в СВС малої амплiтуди.

_K(Ca) . Цi компоненти вiдрiзняються мiж собою не лише провiднiстю каналiв, через якi вони переносяться, але i їх чутливiстю до [Са²⁺ ]_i та змiн мембранного потенцiалу, а також вiдрiзняються кiнетичними характеристиками. Окрiм наведеного вище, цi канали вiдрiзняються чутливiстю до блокаторiв (d-TK, паксилiну, ТЕА). Так, d–TK виступає ефективним блокатором SК каналiв ГМК ШКТ та може бути використаний, як iнструмент для роздiлення та вивчення iонних струмiв.

Локальне пiдвищення Са²⁺ виступає важливою ланкою в регуляцiї мембранного потенцiалу, збудливостi клiтини та агонiстiндукованих реакцiй (Gordienko et al. 1998, Collier et al. 2000). Цi процеси є безпосереднiм результатом вивiльнення iонiв Са²⁺₃²⁺ може призводити до утворення так званої Са²⁺ хвилi, що може розповсюджуватись навколо мiсця iнiцiацiї та через всю клiтину (Gordienko et al. 1998, Jaggar et al. 2000). Локальне вивiльнення Са²⁺²⁺ ]_i²⁺²⁺ . Тому головним зв’язуючим ланцюгом мiж вивiльненням Са²⁺ та клiтинною вiдповiддю, виступає активацiя iонної провiдностi в плазматичнiй мембранi.

Активацiя вихiдного калiєвого струму вiдповiдає за генерацiю неадренергiчних нехолiнергiчних гальмiвних синаптичних потенцiалiв (НАНХ ГСП). На сьогоднiшнiй день загальноприйнята думка, що АТФ, так само як i NO, виступає медiатором гальмiвної нейропередачi в ШКТ (Шуба та iн. 1998, Shuba et al. 2003, Moore et al. 1990). В taenia cаесi морської свинки стимуляцiя НАНХ-нейронiв призводила до генерацiї двофазного ГСП (И. А. Владимирова та iн. 1984,1993). Повiльний компонент цього ГСП блокується iнгiбiторами NO-синтази та харибдотоксином, блокатором BК каналiв (Шуба та iн. 1998, Shuba et al. 2003, Загороднюк та iн. 1994), а швидкий – антагонiстом пуринорецепторiв сурумiном, та блокатором SК каналiв апамiном (Владимирова та iн. 1986, Шуба та iн. 1998, Shuba et al. 2003). Проведенi нами дослiди по вивченню впливу АТФ на поодинокi ГМК taenia cаесi морської свинки показали, що АТФ (100 мкМ) при пiдтримуваному потенцiалi в –40 мВ, призводив до значного приросту СВС малої амплiтуди. При цьому частота СВС великої амплiтуди сильно не змiнювалась. Як було вказано ранiше, СВС малої амплiтуди формуються здебiльшого за рахунок активацiї SК каналiв. Прикладення d-TK, як блокатора SК каналiв, призводило до значного пригнiчення СВС малої амплiтуди, та усунення впливу АТФ. Це збiгається з iснуючими даними на багатоклiтинних препаратах, уявленнями та лiтературними даними (Bayguinov et al. 2000,Shuba et al. 2003). Для встановлення джерела кальцiю, що задiється в цих процесах було використано мембраннопроникний антагонiст ІР₃ рецепторiв – 2-амiноетоксидифенiл борат (2-АРВ) (Maruyama et al. 1997). Преiнкубацiя клiтин в розчинi з 2-АРВ (30 мкМ) не призводила до суттєвих змiн СВС, активованих вивiльненням Са²⁺ з рiанодинових депо. В той же час ефект збiльшення частоти СВС при аплiкацiї АТФ був вiдсутнiй. Дослiдження, проведенi на багатоклiтинних препаратах показували, що 2-АРВ пригнiчував ГСП, викликанi iнтрамуральним подразненням у препаратах caecum та colon, а також АТФ та НА – викликану гiперполяризацiю (Shuba et al. 2003). Це дає можливiсть зробити висновок, що вивiльнення Са²⁺ з ІР₃ чутливого кальцiєвого депо виступає промiжною ланкою в передачi мiж P2Y рецепторами i активуванням К_Са каналiв малої провiдностi, якi приймають участь у генерацiї апамiнчутливого ГСП.

АТФ, як гальмiвний нейромедiатор, взаємодiє у гладеньких м’язах з P2Y рецепторами, котрi вiдносяться до групи метаботропних рецепторiв. Цi рецептори зв’язанi з внутрiшньоклiтинними G-бiлками (G_q/11 ) завдяки яким активують фосфолiпазу С (Kьgelgen et al. 2006). Для визначення ролi фосфолiпази С у генерацiї АТФ-iндукованої вiдповiдi, було використано iнгiбiтор фосфолiпази С – U73122 (Smith et al. 1990). За таких умов, додавання АТФ на фонi U73122 (5 мкМ) не призводило до змiни частоти появи СВС, як великої так i малої амплiтуди. На багатоклiтинних гладеньком’язових препаратах caecum (Shuba et al. 2003), застосування U73122, призводило до зменшення амплiтуди ГСП, викликаного iнтрамуральним подразненням, у порiвняннi з тестовим майже на 50%. Наступне додавання апамiну, блокатора К_Са

²⁺ iз саркоплазматичного ретикулуму, внаслiдок активацiї P2Y рецепторами фосфолiпази С та задiяного нею iнозитолтрифосфатного механiзму.

два компоненти Са²⁺ залежного К⁺ струму.

2. Вихiдний калiєвий струм на 50% блокується неселективним блокатором ВК каналiв ТЕА (1мМ), та на 40% − селективним блокатором ВК каналiв паксилiном (100 нМ).

3. Близько 10% вихiдного калiєвого струму пригнiчується блокатором нiкотинових холiнорецепторiв та К_Ca каналiв d-ТК в концентрацiї 50 мкМ.

4. Спонтаннi вихiднi струми (СВС) за своїми ознаками можна роздiлити на струми малої та великої амплiтуди. СВС великої амплiтуди чутливi до паксилiну та ТЕА. Це вказує, що вони переносяться через ВК канали. СВС малої амплiтуди чутливi до дiї d-ТК, що свiдчить про активацiю SКканалiв.

5. Блокатор ІР₃²⁺ з ІР₃ чутливого Са²⁺ депо мiоцитiв.

7. АТФ в присутностi селективного блокатора фосфолiпази С U73122 (5 мкМ) не впливає на частоту та амплiтуду СВС

8. АТФ-iндукований Са²⁺ залежний калiєвий струм в мiоцитах taenia caeci обумовлений залежним вiд фосфолiпази С збiльшенням внутрiшньоклiтинного рiвня ІР₃ , та наступним вивiльненням Са²⁺ з ІР₃ чутливого депо мiоцитiв.

1. Nessin V. V. Purenergic activation of the cationic conductivity in the guinea pig // Нейрофiзiологiя/Neurophysiology – 2003. – T. 35, № 3/4, – C. 361.

2. Несiн В. В. , Кришталь Д. О., Шуба М. Ф. d-тубокураринчутливий компонент кальцiйзалежного калiєвого струму в мiоцитах taenia coli морської свинки // Нейрофiзiологiя/Neurophysiology – 2005. – Т. 37, № 3, – С. 271-276. (Всi електрофiзiологiчнi дослiдження, обробка експериментального матерiалу та написання статтi виконано особисто автором).

3. , Кришталь Д. О., Шуба М. Ф. Характеристикипаксилiнчутливого кальцiйзалежного калiєвого струму iзольованих мiоцитiв кишечнику, Нейрофiзiологiя/Neurophysiology – 2007. – Т. 39, № 3, – С. 201-207. (Всi електрофiзiологiчнi дослiдження, обробка експериментального матерiалу та написання статтi виконано особисто автором).

, Шуба М. Ф. Модуляцiя калiєвого струму А-типу в гладеньком’язових клiтинах vasdeferens щура кальцiй/кальмодулiнзалежною протеїнкiназою ІІ // Нейрофизиология/Neurophysiology. – 2007. – Т. 39, № 4/5, – С. 419-422. (Приймав участь у обробцi експериментального матерiалу, узагальненнi та обговореннi результатiв дослiджень).

5. Кришталь Д. О., Несiн В. В. , Шуба М. Ф. Дiя паксилiну на кальцiйзалежний калiєвий струм в iзольованих гладеньком’язових клiтинах сiм’явивiдних протокiв щура // Фiзiологiчний журнал. – 2007. – Т. 53, № 5, - С. 67-74. (Автор приймав участь у обробцi експериментального матерiалу та написаннi статтi).

Тези доповiдей

1. Nessin V. V. Purenergic activation of the spontaneous transient outward current in the guinea pig // Abstract book of IBRO Advanced School of Neuroscience “Receptor, Channels, Messengers”, Yalta, September 16-28, 2004.

2. Несiн В. В. Властивостi спонтанних вихiдних струмiв, викликаних пуринергiчною активацiєю мiоцитiв кишечнику морської свинки // Матерiали мiжнародної конференцiї “Клiтиннi i субклiтиннi механiзми функцiонування травної системи”, приуроченої до 80-лiття з дня народження проф. І. В. Шостакової. – С. 55. Львiв, 7–9 жовтня 2004.

3. Несiн В. В. , Кришталь Д. О., Шуба М. Ф. Властивостi катiонного струму активованого АТФ у мiоцитах кишечнику морської свинки // Матерiали І Української наукової конференцiї “Проблеми бiологiчної i медичної фiзики ” – С. 124. Харкiв, 20-22 вересня 2004.

4. Несiн В. В. Вплив d-тубокурарину на кальцiйзалежний калiєвий струм в iзольованих гладеньком’язових клiтинах кишечнику // Матерiали мiжнародної наукової конференцiї “Механiзми функцiонування фiзiологiчних систем”, приуроченої до 60-лiття новоствореної кафедри фiзiологiї людини i тварин Львiвського унiверситету iм. Івана Франка. – С. 107. Львiв, 8-11 листопада 2006.

5. Властивостi паксилiнчутливої компоненти кальцiйзалежного калiєвого струму iзольованих гладеньком’язових клiтинах кишечнику // Матерiали 4-го з’їзду Українського бiофiзичного товариства – С. 79. Донецьк, 19-21 грудня 2006.

Несiн В. В. Властивостi кальцiйактивованих та АТФ-iндукованих калiєвих струмiв мембрани мiоцитiв taenia caeci морської свинки. – Рукопис.

З використанням методу фiксацiї потенцiалу було проведено роздiлення трансмембранних вихiдних калiєвих струмiв. Показано, що вихiдний калiєвий струм на 50% блокувався неселективним блокатором К⁺ каналiв ТЕА (1мМ), та на 40 % – селективним блокатором ВК каналiв паксилiном (100нМ). Близько 10% вихiдного калiєвого струму пригнiчується блокатором нiкотинових холiнорецепторiв та SК каналiв – d-тубокурарином (d-TK) в концентрацiї 50 мкМ. Вивчення впливу наведених блокаторiв на спонтаннi вихiднi струми (СВС) показало, що останнi за своїми ознаками можна роздiлити на струми малої та великої амплiтуди. СВС великої амплiтуди чутливi до паксилiну та ТЕА. Це вказує, що вони переносяться через ВК канали. СВС малої амплiтуди чутливi до дiї d- TK. Це свiдчить пор те, що вони переносяться через SК канали.

Дослiдження СВС пiд час прикладання АТФ показало, що основна роль в пуринергiчному гальмуваннi, належить SК каналам, як основному механiзму гiперполяризацiї мембрани ГМК. Дослiдження внутрiшньоклiтинних шляхiв гальмування, викликаного активацiєю пуринорецепторiв мембрани ГМК показало, що блокатор ІР₃ рецепторiв 2-АРВ (30мкМ) пригнiчував частоту СВС малої амплiтуди та не впливав на СВС великої амплiтуди. Це свiдчить, що результатом виникнення СВС малої амплiтуди є вивiльнення Са²⁺₃ -чутливого Са²⁺

Таким чином можна сказати, що АТФ−iндукованi СВС в мiоцитах taenia caeci обумовленi вивiльненням Са²⁺ з ІР₃ чутливого депо, шляхом залежним вiд фосфолiпази С збiльшенням внутрiшньоклiтинного рiвня ІР₃ .

Ключовi слова: гладеньком’язовi клiтини, taenia caeci , АТФ, СВС, d-тубокурарин.

Несин В. В. Свойства кальцийактивированих и АТФ-индуцированых калиевых токов мембраны миоцитов taenia caeci морской свинки. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00. 02 – биофизика. – Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2007.

Работа посвящена фармако-биофизическому изучению компонентов суммарного трансмембранного ионного тока миоцитов taenia cаесi морской свинки и выяснению клеточных механизмов действия АТФ как медиатора торможения ЖКТ морской свинки. С помощью метода фиксации потенциала было проведено разделение трансмембранных выходящих калиевых токов. Показано, что выходящий калиевый ток на 50% блокируется неселективным блокатором К⁺ каналов ТЕА (1мМ), и на 40% − селективным блокатором ВК каналов паксилином (100нМ). Для снятия неоднозначности, связанной с действием апамина (активация неселективного катионного тока) в наших опытах в качестве блокатора SК каналов был применен d-TK, которий является широко известным блокатором никотинных холинорецепторов. Около 10% выходящего калиевого тока угнетается блокатором никотиновых холинорецепторов и SК каналов - d-тубокурарином (d-TK) в концентрации 50мкМ. Изучено влияние этих блокаторов на спонтанные выходящие токи (СВТ). Показано, что последние по своим характеристикам могут быть разделены на токи малой и большой амплитуды. СВТ большой амплитуды чувствительны к действию паксилина и ТЕА, и переносятся через ВК каналы. СВТ малой амплитуды чувствительны к d-TK и переносятся через SК каналы.

Изучение АТФ−вызванных СВТ показало, что основная роль в пуринергическом ответе принадлежит SК каналам. Активация пуринорецепторов приложением АТФ (100мкМ) при −40мВ сопровождается значительным приростом частоты СВТ малой амплитуды 60±5% (n=4). Использование d-TK, в качестве блокатора SК каналов, приводило к угнетению СВТ малой амплитуды, и устранению эффекта действия АТФ. Исследование клеточных путей торможения, вызванного активацией пуринорецепторов мембраны миоцитов, показало, что блокатор ІР₃ рецепторов 2-АРВ (30мкМ) уменьшал частоту СВТ малой амплитуды и не влиял на СВТ большой амплитуды. Это свидетельствует о том, что результатом возникновения СВТ малой амплитуды является освобождение Са²⁺ из ІР₃ чувствительного Са²⁺ депо миоцитов. Приложение АТФ на фоне 2-АРВ (преинкубация 10 мин) не сопровождалось увеличением частоты СВТ. Для изучения роли фосфолипазы С в АТФ−индуцированных ответах, был использован ингибитор фосфолипазы С - U73122. На фоне U73122 аппликация АТФ не приводила к увеличению частоты и амплитуды СВТ. Таким образом, можно сказать, что АТФ−вызванные СВТ в миоцитах taenia caeci обусловлены освобождением Са²⁺ через ІР₃ чувствительние рецепторы саркоплазматического ретикулума вследствие зависимого от фосфолипазы С увеличения уровня внутриклеточного ІР₃ .

Ключевые слова: гладкомышечные клетки, taenia caeci, АТФ, СВТ, d-тубокурарин.

Nesin V. V. The properties of Ca²⁺ -activated and ATP-induced potassium currents of smooth muscle cell membrane of guinea-pig taenia caeci . – the Manuscript.

The dissertation is devoted to pharmacological and biophysical investigations of the components of outward transmembrane ionic current in single smooth muscle cells isolated from guinea-pig taenia caeci and clarifying the mechanisms of the action of ATP as an inhibitory neurotransmitter in guinea-pig gastrointestinal tract. Different components of the net outward current were separated using patch-clamp technique. It was shown that outward potassium current was inhibited at 50 % by application of 1 mM of non-selective potassium channels blocker TEA and at 40 % - by application of 100 nM of high-specific BK channels blocker paxilline. About 10 % of the net outward current was suppressed by application of 50 мM of SK channels and nicotinic cholinergic receptors d-tubocurarine (d-TK). Effects of these blockers on the spontaneous transient outward currents (STOCs) were also studied. It was shown that STOCs could be divided on two groups depending on its characteristics. Large STOCs are sensitive to the blocking action of TEA and paxilline and thereby are likely to determined by BK channels activity. Mini STOCs are sensitive to d-TK which is an evidence for involving of SK channels.

of the intracellular pathways of inhibition induced by an activation of SMC purinoergic receptors testified that a blocker of IP₃ receptor 2-APB (30 мM) decreased frequency mini STOCs and did not alter large STOCs. In result , we can assume that origin of small amplitude STOCs is due to calcium release from sarcoplasmic reticulum of SMC through IP₃ receptors. The additional application of ATP(100 мM) along with 2-APB as well as with U73122 (blocker of phospholipase C) did not invoke increase in frequency and amplitude of STOCs.

Thus, ATP induced STOCs in SMC of taenia caeci are generated due to enhancement of flux of calcium caused by activation of PLC and, consequently, increasing production of IP₃ which, in turn, leads to activation of IP₃ sensitive receptors of sarcoplasmic reticulum membrane.

Keywords: smooth muscle cells, taenia caeci, ATP, STOCs, d-tubocurarine.