Хроматография
Хроматографический метод – физико-химический метод разделения компонентов сложных смесей газов, паров, жидкостей или растворенных веществ, основанный на использовании сорбционных процессов в динамических условиях.
Классификация хроматографических методов:
По агрегатному состоянию подвижной и стационарной фазы.
Стационарная фаза |
Подвижная фаза |
газ |
жидкость |
|
Газо-адсорбционная |
Адсорбционная, Ионообменная, Гельфильтрация, Аффинная |
|
Газо-жидкостная |
Распределительная |
гелий, водород.
газ. По существу это вариант распределительной хроматографии.
По механизму разделения.
Адсорбционная, распределительная, ионообменная, гельфильтрация, аффинная хроматография.
Хроматография низкого давления, хроматография высокого давления.
Гидравлическая схема любого хроматографа включает в себя насос, дозатор, колонку и детектор.
Основное назначение насосов в ВЭЖХ состоит в создании стабильного потока элюента при установленном в определенном диапазоне расходе и обеспечении давления, необходимого для пропускания элюента при этом расходе через колонку. Имеется два принципиально различных типа насоса: постоянного давления и постоянного расхода. Первый тип насоса поддерживает установленное постоянное давление на входе в колонку, а расход определяется ее сопротивлением. Второй тип насоса поддерживает постоянный расход элюента, а давление на входе в колонку определяется ее сопротивлением.
Основными характеристиками насосов являются: максимальное давление, диапазон расходов, стабильность поддержания расхода или давления, инертность по отношению к элюенту и пробе, простота сборки и разборки.
Стабильность потока элюента непосредственно влияет на погрешность и воспроизводимость результатов анализа, а также на уровень флуктуационных шумов нулевого сигнала некоторых типов детекторов. В целях сглаживания пульсаций в современных насосах применяют различные демпферирующие устройства, многоголовочные системы поршневых насосов, а также микропроцессорный контроль пульсаций. Так как насосы в жидкостной хроматографии должны работать с любыми элюентами в дипазоне рН от 3 до 10, в том числе с кислотами, растворами солей агрессивными органическими жидкостями, высокие требования, как правило предъявляются к конструкционным материалам насосов.
Наилучшим материалом для корпуса насоса служит титан и его сплавы с палладием или цирконием. Допускается использование коррозионно-стойкой стали. Для плунжеров и шариковых клапанов наилучшим материалом являются лейкосапфир и рубин. Сальники обычно изготавливают из фторопласта или полиимида. Детали насосной системы, контактирующие с элюентом, должны соединяться переходниками из тех же материалов, из которых изготовлен насос. Применение сварки и пайки не допускается.
Насос постоянного давления с пневмогидравлическим усилителем. Расход элюента зависит от заданного входного давления воздуха и сопротивления колонки. Такой насос может быть легко модифицирован для работы при давлениях до 100 МПа. В этом случае с помощью него можно проводить упаковку колонок различного диаметра и длины.
К насосам постоянного расхода относятся шприцевые, поршневые, мембранные.
Шприцевой насос обеспечивает постоянный расход элюента без пульсаций. Насос однократного заполнения, по этой причине возникают трудности с быстрой сменой элюента.
от двигателя насоса. Насос на входе и выходе имеет обратные шариковые клапаны. Для надежной работы насоса необходимо полное отсутствие в элюенте твердых взвешенных частиц и пузырьков воздуха. Для устранения частиц применяют пористые фильтры, а для устранения воздуха растворители дегазируют. д. ля сглаживания пульсаций применяют демпферирующие устройства, а также двухплунжерные насосы (сдвиг работы плунжеров на 180) и трех плунжерные (сдвиг работы плунжеров на 120).
Одной из модификаций одноплунжерного насоса является мембранный насос. Давление создаваемое плунжером в камере насоса, заполненной инертной малолетучей жидкостью, передается на мембрану, которая вытесняет элюент через обратный клапан.
СИСТЕМЫ ВВОДА ПРОБЫ
Требования к системе ввода пробы:
Обеспечивать максимальную точность и воспроизводимость;
Сохранить неизменность количественного и качественного состава смеси до и после дозирования.
Способы ввода пробы
С остановкой потока и без остановки потока.
С остановкой потока – через вращающийся кран или через мембрану. Через мембрану лучше остановить поток, т. к. это не требует специальных шприцов для высокого давления. Мембрана набухает от растворителя, выкрашивается вследствие частых уколов в нее шприцом.
Без остановки потока через вращающийся кран. Петля обеспечивает постоянный объем, который попадает в колонку.
КОЛОНКИ
Хроматографическая колонка является одним из основных узлов хроматографа; ее задача – разделение смеси на отдельные компоненты.
Принято считать, что наибольшая эффективность колонки достигается в том случае, когда скорость прохождения потока через слой сорбента примерно равна скорости молекулярно диффузии в поры частиц. Коэффициент диффузии растворенного вещества в подвижной фазе зависит от типа сорбата, так и от типа и свойств используемого растворителя. Диффузия тем больше, чем ниже вязкость растворителя и чем меньше размер молекул растворенного вещества. Переход к использованию более мелких частиц в жидкостной хроматографии привел к уменьшению влияния внешне диффузионных процессов, но одновременно выдвинул требование существенного улучшения однородности слоя упакованных частиц.
Для оценки эффективности колонки используется понятие высоты теоретической тарелки.
ДЕТЕКТОРЫ
Специфические и неспецифические.
Чувствительность детектора
Предел детектирования
Пределом детектирования называется минимальное содержание вещества в подвижной фазе, доступное обнаружению хроматографическим детектором. Принято считать предел детектирования равным удвоенной амплитуде шумов.
Уровень флуктуационных шумов.
Определяется как расстояние между крайними положениями нулевой линии за определенное время и при частоте флуктуаций не менее 0,05 Гц.
Наиболее распространенными детекторами в жидкостной хроматографии являются оптические детекторы: Абсорбционные 190нм-380нм, 380 – 800нм; инфракрасные детекторы 800 –5000нм; рефрактометрические; эмиссионные, флуорометрические; хемолюминесцентные.
Ультрафиолетовый детектор (специфичный) определяет зависимость степени поглащения света от концентрации пробы в проточной ячейке. Эта зависимость имеет линейный характер и определяется законом Бугера-Ламберта-Бэра.
Требования к растворителям:
Инфракрасный детектор может служить может служить для идентификации природы органических соединений, так как многие группы органических веществ имеют характеристические полосы поглащения
в изменение показателя преломления растворителя пропорционален объемной концентрации этого вещества.
Принцип действия основан на измерении излучения поглощения света в виде флуоресценции. Поглощение обычно проводят в УФ-области при длине волны максимального поглощения для данной группы веществ, а излучение фиксируют через фильт, не пропускающий лучи возбуждения. Длина волны флуоресцентного излучения всегда выше длины волны поглощенного света. В связи с тем, что детектирование ведется от нулевой интенсивности, ФД более чувствительны, чем детекторы поглощения.
tR
– время удерживания. Складывается из времени пребывания вещества в подвижной и неподвижной фазах. (формула)
tM
t’R
– время пребывания молекул в неподвижной фазе.
t’RM неподвижной фазах. Поэтому отношение получило название отношения распределения масс, но более распространенное название – коэффициент емкости (коэффициент извлечения).
k= (tR
-tM
)/tM
Значение k может изменяться от нуля до бесконечности.
Отношение коэффициентов емкости компонентов смеси называют коэффициентом разделения a, или селективностью.
a=k2
/k1
На описанные выше параметры отрицательно влияет размывание зон отдельных компонентов, обусловленное диффузионными процессами. Размывание хроматографических зон обусловлено в основном тремя следующими причинами:
Неоднородностью потока по сечению колонки, вследствие которой молекулы разделяемого вещества проходят пути различной длины. (Влияние этого эффекта минимально, если колонка заполнена равномерно частицами малого диаметра с одинаковыми размерами).
Диффузией и сопротивлением массопередаче молекул, перемещающихся из одной фазы в другую, и отклонением от состояния равновесия вследствие диффузии. Снижение объемной скорости и использование насадки с малым размером частиц и открытой пористой структурой (это снижает длину диффузионного пути) уменьшает влияние этого эффекта. Повышение температуры колонки также уменьшает сопротивление массопередаче, так как увеличивает коэффициенты диффузии и уменьшает вязкость.
Мерой размывания полосы вещества в колонке является высота эквивалентой теоретической тарелке (ВЭТТ). ВЭТТ описывает эффекты, приводящие к размыванию узкой зоны вещества при его перемещении вместе с подвижной фазой вдоль колонки. Любой хроматографический анализ следует проводить в таких условиях, чтобы при заданной длине колонки число теоретических тарелок было максимальным и, следовательно, высота минимальной.
Оптимизация хроматографического процесса в целом должна предусматривать как улучшение разделения компонентов смеси, так и уменьшение размывания зон. Параметр, учитывающий оба эти требования, служит критерием достигнутой оптимизации хроматографического процесса. Его называют разрешением RS и определяют как отношение расстояния между максимумами двух соседних пиков к среднему арефмитическому их ширины по нулевой линии:
RS
=(2(tR2
-tR1
))/(w1
+w2
)
Первым делом, литературный поиск может обнаружить существование разделения для похожего образца. Хотя этот способ часто указывает на установление условий, которые кто-то еще нашел полезными, метод можно будет использовать с трудом. Мы должны всегда применять KISS принцип (делай проще, глупее) когда разрабатываем подвижные фазы - меньше составляющих, меньше разнообразий, которые могут вызвать проблемы. Обычно, лучше всего начинать новый метод с "пробной точки", а не полагаться на литературный метод.
Второй способ для подбора приблизительных начальных условий заключается в том, чтобы систематично подогнать состав растворителя для получения приемлемых времен удерживания. Первое, коэффициент емкости, k, должен быть в диапазоне от 1 до 20 для всех интересующих соединений. Лучше все же использовать коэффициенты емкости между 2 и 10. Второй полезный инструмент - это ПРАВИЛО ТРЕХ, которое сообщает, что k изменяется приблизительно в три раза при изменении концентрации органического растворителя на 10%.
АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Адсорбция.
Сущность адсорбции заключается в том, что молекулы пребывают на поверхности твердого тела в течение какого-либо времени, пока не получат за счет флуктуации теплового движения достаточно энергии, чтобы преодолеть удерживающие силы. Адсорбция бывает физическая, обусловленная вандерваальсовыми силами, и химическая, приближающаяся по величине к силам химических связей. Как привило, нельзя точно определить, за счет каких сил в действительности происходит адсорбция.
В твердых веществах только частицы поверхностного слоя могут взаимодействовать с посторонними молекулами. Поверхностные силы сродства равномерно распределены по всей поверхности, Однако, имеются участки, на которых адсорбционные силы особенно велики – это активные центры. В случае с силикагелем – это силанольные группы.
Процесс адсорбции можно наглядно представить с помощью изотерм адсорбции. Обычно течение процесса на колонке описывается изотермами Ленгмюра и Фрейндлиха. Однако, все теории, посвященные адсорбции, разработаны для случая твердое тело-газ. Система твердая фаза-жидкость по своим свойствам больше похожа на систему жидкая фаза-газ. При адсорбции га границе твердая фаза-жидкость наблюдается конкурентная адсорбция между молекулами растворителя и растворенного вещества. Принято считать, что конкурентная адсорбция почти отсутствует в системе твердая фаза-газ. Поэтому только линейный участок изотермы адсобрции Ленгмюра и Фрейндлиха достоверно описывает процесс адсорбции на границе твердая фаза-жидкость. Таким образом, можно говорить только об общих закономерностях адсорбции на границе твердая фаза-жидкость:
Правило Траубе. Адсорбция увеличивается в 3 – 3,5 раза при увеличении длины цепи на 1 звено.
Правило уравнивания полярностей Ребиндера. Процесс адсорбции идет в сторону выравнивания полярностей фаз, и тем сильнее, чем больше первоначальная разность полярностей.
Влияние структуры соединений на разделение.
В первом приближении можно считать, что каждая группа вносит определенный вклад в удерживание, причем чем выше полярность группы, тем больше этот вклад.
Растворители.
Элюотропный ряд Траппе:
Вода, метанол, этанол, пропиловый спирт,
ацетон, этилацетат, диэтиловый эфир, хлороформ, хлористый метилен,
ТГФ, бензол, толуол, гексан
Требования к сорбентам.
Большая емкость. Возможно большую активную поверхность. Большая активная поверхность является либо следствием его пористости, либо высокой дисперсности (малого размера частиц).
Одинаковая величина и форма. Позволяет лучше разделят вещества и способствует лучшей проницаемости колонки.
Селективность.
Инертность.
Описано много способов стандартизации адсорбентов. Наибольшее распространение получил способ приготовления стандартных сорбентов и определения их активности при помощи азокрасителей, описанный Брокманом.
По степени активности сорбенты можно расположить следующим образом:
активированный уголь, окись алюминия, окись магния,
силикагель, природные силикаты,
|